HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦與正常產(chǎn)婦臍帶血漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞中PI3K、mTOR、p70S6K、IFNα的表達(dá)情況分析

楊雯珺， 霍 燚， 彭建平

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 長(zhǎng)沙 410007； 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝病科， 長(zhǎng)沙 410007

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，截至2017年，全世界約有2.57億慢性HBV感染者[1]。乙型肝炎仍是世界及我國(guó)的一項(xiàng)重大傳染病，HBV感染者常因進(jìn)展為肝癌、重型肝炎及肝硬化失代償期并發(fā)癥死亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期間免疫活性的改變會(huì)影響乙型肝炎的自然史，包括增加乙型肝炎發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道[3]，HBV慢性感染的婦女在妊娠期間乙型肝炎發(fā)作的流行率為6%～14%。慢性乙型肝炎相關(guān)的妊娠期糖尿病、產(chǎn)前出血、早產(chǎn)等均有報(bào)道[4]。與其他導(dǎo)致肝硬化的原因相似，乙型肝炎肝硬化確實(shí)增加了母親和胎兒的死亡風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此防治乙型肝炎仍是一項(xiàng)重要的工作。機(jī)體免疫應(yīng)答功能的損害及HBV cccDNA在肝細(xì)胞核內(nèi)潛伏是導(dǎo)致乙型肝炎慢性化及難以根治的重要原因[6-7]。研究[8]顯示，核苷酸類(lèi)似物聯(lián)合序貫PEG-IFN治療能提高HBsAg陰轉(zhuǎn)率，提示提高機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能可以增強(qiáng)清除HBV的能力。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells, pDC)是一種重要的免疫細(xì)胞，通過(guò)產(chǎn)生大量IFN及抗原遞呈誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答抗病毒[9]。有實(shí)驗(yàn)[10]證實(shí)：PI3K-mTOR-p70S6K信號(hào)通路是pDC 產(chǎn)生Ⅰ型IFN的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路。在此背景下，本實(shí)驗(yàn)比較了乙型肝炎免疫耐受期產(chǎn)婦與正常產(chǎn)婦pDC中PI3K、mTOR、p70S6K及培養(yǎng)上清IFNα表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院部2017年10月-2020年1月健康產(chǎn)婦10例(正常組)及HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血20例(足月產(chǎn)產(chǎn)婦)(乙型肝炎組)，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[11]。排除：(1)合并其他肝臟疾病、肝硬化、重型肝炎的患者；(2)合并HIV感染者；(3)合并糖尿病、冠心病、高血壓、惡性腫瘤等其他心、腦、腎、肺慢性疾病；(4)合并免疫性疾病及使用免疫抑制劑治療者。

1.2 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)蠊?，PBS、RPMI-1640(Thermo公司)，Recombinant Human IL-3、Flt3-L(peprotech，catalog#:200-03、300-19)，BDCA-2-PE、CD123-FITC、BDA-4-APC及同型對(duì)照抗體(德國(guó)Miltenyi Biotec公司)，CpG-A(5′-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3′，上海生物工程有限公司)，Trizol(ambion，15596026)，SYBR Green PCR試劑盒(KAPA Biosystems，KM4101)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA，639505)，DNaseⅠ(Fermentas，AM2295)，DEPC處理水(bioswamp,RN1680)，引物由武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司合成，人IFNα ELISA試劑盒(Bioswamp,HM10251)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 臍帶血pDC的體外培養(yǎng)及鑒定 按照已建立的體外分離培養(yǎng)臍帶血pDC的方法進(jìn)行培養(yǎng)及鑒定[12]。在培養(yǎng)的第7天加入CpG-A，24 h后分別收集細(xì)胞及上清液，分組標(biāo)記，進(jìn)行后續(xù)相應(yīng)的mRNA、蛋白及INFα檢測(cè)。

1.3.2 real-time PCR檢測(cè)pDC中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA定量 引物序列見(jiàn)表1。收集第8天的pDC，用Trizol提取pDC總mRNA，用DNase1消除總RNA中的DNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄盒說(shuō)明合成cDNA單鏈模板，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：SYBRGreen mix 10 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 8 μl，總體積20 μl。反應(yīng)程序：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s；56 ℃，10 s；72 ℃，25 s；39個(gè)循環(huán)；65 ℃，5 s；95 ℃，50 s。以β-actin為內(nèi)參，用2-△△CT公式計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)定量。

表1 引物序列表

1.3.3 Western Blot檢測(cè)pDC中PI3K、mTOR、p70S6K 蛋白定量 配備溶液制膠，在pDC中加入蛋白酶及磷酸酶抑制劑的裂解液裂解細(xì)胞，加熱，離心棄上清，提取出pDC總蛋白，定量蛋白，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉膜，抗體孵育，顯色。使用軟件測(cè)量蛋白條帶灰度值。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液上清的IFNα 按照ELISA試劑說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定上清中的IFNα，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物濃度與OD值得出直線方程，根據(jù)每個(gè)樣本OD值計(jì)算出樣本IFNα的濃度。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：AF/SC-07/02.0)。

2 結(jié)果

2.1 臍帶血pDC流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 細(xì)胞表面分子CD123、CD303、CD304均表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞為pDC，占17.22%，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 兩組pDC中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)情況

與正常組比較，乙型肝炎組臍帶血pDC PI3K、mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)水平顯著降低(P值均<0.001)(表2)。

表2 兩組產(chǎn)婦臍帶血pDC中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3 兩組pDC中PI3K、mTOR、p70S6K 蛋白表達(dá)情況與正常組比較，乙型肝炎組臍帶血pDC PI3K、mTOR、p70S6K 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P值均<0.05)(表3，圖2)。

2.4 兩組培養(yǎng)液上清IFNα表達(dá)情況 正常產(chǎn)婦與HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDC培養(yǎng)上清IFNα分別為(12 663.06±1286.96)pg/ml、(6069.77±953.23)pg/ml，與正常產(chǎn)婦比較，HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDC 培養(yǎng)上清IFNα表達(dá)水平顯著降低(t=-15.88，P<0.05)。

表3 兩組產(chǎn)婦臍帶血pDC中PI3K、mTOR、p70S6K蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

近年來(lái)在HBV研究中，pDC受到重視，pDC產(chǎn)生體內(nèi)95%左右的Ⅰ型IFN，pDC通過(guò)Toll樣受體(TLR)9識(shí)別病毒，由包含髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、PI3K、mTOR、p70S6K、IFN調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor，IRF) 7等分子的通路產(chǎn)生大量Ⅰ型IFN[9-10]，IFN通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞合成的抗病毒蛋白抑制病毒復(fù)制，并調(diào)節(jié)NK細(xì)胞、DC、輔助性T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等抗病毒[13]，同時(shí)，pDC還作為抗原遞呈細(xì)胞，活化B淋巴細(xì)胞及效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，激活體液免疫及細(xì)胞免疫抗病毒[9]，研究[14-15]表明在多種慢性病毒感染性疾病，包括急慢性HBV感染，患者外周血pDC數(shù)量減少、功能亦受損。有實(shí)驗(yàn)[16]證實(shí)，HBV能抑制TLR9-IRF7-IFNα信號(hào)通路，從而抑制pDC分泌IFNα，從而逃逸機(jī)體的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致HBV持續(xù)的慢性感染。pDC功能受損是乙型肝炎慢性化的重要原因之一。

PI3K-mTOR-p70S6K信號(hào)通路參與了多種重要的細(xì)胞生理功能,該途徑的異常能導(dǎo)致惡性腫瘤、免疫性疾病、病毒感染不能清除等[17-18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，抑制HepG2細(xì)胞的PI3K-Akt-mTOR通路，促進(jìn)HBV的復(fù)制。Cao等[10]研究顯示TLR9介導(dǎo)的pDC產(chǎn)生IFN的過(guò)程需要PI3K-mTOR-p70S6K信號(hào)通路參與，抑制mTOR及p70S6K導(dǎo)致IFNα減少。國(guó)內(nèi)外關(guān)于HBV影響PI3K-mTOR-p70S6K通路亦有類(lèi)似報(bào)道。HBV治療性疫苗-可溶性CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白疫苗降低CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)CD8+T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)，并誘導(dǎo)HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞免疫功能，研究[20]表明，該疫苗實(shí)現(xiàn)以上功能亦是通過(guò)PI3K-mTOR-p70S6K通路的激活實(shí)現(xiàn)的。

新生兒臍帶血DC是研究免疫耐受較好的細(xì)胞模型。研究[21]發(fā)現(xiàn)，健康胎兒臍血DC功能明顯下降，其原因?yàn)樽匀划a(chǎn)生免疫耐受，防止對(duì)胚胎的免疫排斥反應(yīng)；孕婦分娩時(shí)臍帶血pDC及mDC百分比較健康人外周血明顯下降。推測(cè)妊娠期間DC數(shù)量的減少在維持針對(duì)胚胎的免疫耐受中起著重要作用[22]。還有研究[23]表明，臍帶血DC特異性表面分子、基因和蛋白的表達(dá)明顯降低，這可能導(dǎo)致臍帶血DC誘導(dǎo)的CD8+T淋巴細(xì)胞活化的細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺乏啟動(dòng)因素。臍帶血DC中表達(dá)顯著降低的基因和蛋白也可能與先天性和適應(yīng)性免疫功能和特性有關(guān)[23]。故本研究以HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDC為研究對(duì)象，能更好地反映機(jī)體感染HBV后的免疫耐受狀態(tài)。

關(guān)于HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDC PI3K、mTOR、p70S6K及IFNα表達(dá)的變化，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)研究。本研究比較HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血與健康產(chǎn)婦臍帶血pDC PI3K、mTOR、p70S6K及IFNα表達(dá)的變化，進(jìn)一步闡述HBV感染免疫耐受的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染免疫耐受期產(chǎn)婦臍帶血pDC中PI3K、mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表達(dá)水平及培養(yǎng)上清IFNα水平較正常產(chǎn)婦明顯下降，提示pDC功能低下，是乙型肝炎慢性化的可能原因之一。分析可能的原因：(1)HBV和HBsAg抑制PI3K-mTOR-p70S6K信號(hào)通路中p70S6k磷酸化，進(jìn)而抑制IRF7磷酸化和IFNα基因轉(zhuǎn)錄。有學(xué)者[24]通過(guò)體外培養(yǎng)pDC，用HBV和HBsAg體外干預(yù)，發(fā)現(xiàn)HBV和HBsAg阻斷了CpG-A/TLR9誘導(dǎo)的、mTOR介導(dǎo)的S6磷酸化以及隨后的IRF7磷酸化和IFNα基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致pDC產(chǎn)生IFNα功能受抑制。(2)HBV導(dǎo)致TLR9-MyD88復(fù)合物的損害，進(jìn)而導(dǎo)致IRF7的磷酸化及核轉(zhuǎn)位中斷[10]。(3)除了HBV對(duì)pDC的直接影響外，HBV也能干擾pDC與單核細(xì)胞的相互作用,間接影響pDC產(chǎn)生IFNα的功能[24]。HBV感染介導(dǎo)pDC產(chǎn)生IFNα的過(guò)程涉及復(fù)雜的信號(hào)通路，該實(shí)驗(yàn)僅觀察了較為重要的PI3K、mTOR、p70S6K指標(biāo)，信號(hào)通路中的其他分子如Akt、PIP3、PDK-1、PTEN、TSC1、TSC2、mTORC1、mTORC2、eIF-4E等及各種分子相互間作用有待進(jìn)一步研究。