艾塞那肽對NAFLD 大鼠SREBP1、ACCα 及SCD1 表達的影響

梁蔚蔚，李曉波，李 燕，劉 華，武俊紫

（云南省第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學科，云南昆明 650032）

近年來我國人民的生活水平日益提高，飲食結(jié)構(gòu)和生活方式發(fā)生明顯改變，肥胖、脂肪肝、2型糖尿病、代謝綜合征等患者逐年增多。其中，非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 是世界范圍內(nèi)最常見的肝病，10 a 前即有報道NAFLD 與糖尿病、心血管疾病等密切相關(guān)[1-2]，日益受到廣泛重視。NAFLD 是指除外過量飲酒和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內(nèi)脂肪沉積。NAFLD 病變主體在肝小葉，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性和脂肪貯積為病理特征的臨床病理綜合征。包括從單純的肝脂肪變性（simple nonalcoholic fattyliver，NAFL） 到非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholicsteatohepatitis，NASH），以致一部分最終發(fā)展為肝硬化（Cirrhosis），甚至演變?yōu)楦渭毎愿伟╤epatocellularcarcinoma，HCC）。目前，NAFLD 在全球及亞洲人群患病率約為25%[3-4]，我國的患病率為6%～27%[5]。然而，目前尚無確切治療NAFLD 的藥物，對NAFLD 治療有效的藥物是有限的。研究顯示，維生素E 和胰島素增敏劑噻唑烷二酮TZDs 吡格列酮可以改善NAFLD 肝酶水平及肝臟組織學表現(xiàn)，但兩種藥物均缺乏長期療效和安全性[6-7]。國內(nèi)研究顯示，黃連素可治療伴糖代謝異常的NAFLD 患者，降低肝臟脂肪含量，增加胰島素敏感性，隨機雙盲對照試驗尚在進行中[8]。

體重減少3%～5%可能會改善肝臟脂肪變性，但減少肝臟炎癥需要更顯著的體重下降（5%～10%體重）[6，9-10]。目前治療NAFLD 最安全、有效的方法是改變生活方式、降低體重[11]，然而有效率僅50%[9]。艾塞那肽作為GLP-1 的一種受體動劑，近年來發(fā)現(xiàn)其具有顯著的減肥作用，能控制食欲、減少食物吸收，同時調(diào)節(jié)脂肪代謝，降低血糖而不引起低血糖反應(yīng)[12-13]。本研究觀察艾塞那肽治療后NAFLD 大鼠肝臟病理、胰島素抵抗、SREBP-1、ACCα 以及SCD1 表達的改變，探討艾塞那肽對NAFLD 大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明醫(yī)科大學動物實驗中心提供150 只實驗用 SD 大鼠[（合格證號:SYXK （Yunnan）2011-0004]，每只大鼠體重約為180～200 g。

1.2 動物模型的建立及分組給藥

1.2.1 NAFLD 大鼠的模型建立 NAFLD 大鼠造模使用的灌胃100%高脂溶液的配方為：97%豬油（市場自購）、2%膽固醇、及1%膽酸鈉。大鼠灌胃量為每100 g 大鼠體重予1 g 高脂溶液。每天早上7:00-9:00 灌胃，持續(xù)12 周。高脂飲食灌胃12 周后，HE 染色顯示肝臟組織脂肪變性及血清肝功能的改變是評價大鼠造模成功的重要因子[14-15]。

1.2.2 分組和給藥劑量 SD 大鼠灌胃造模成功后，100 只隨機分為模型對照組（HFD）、艾塞那肽低劑量（ELD）、中劑量（EMD）、高劑量（EHD） 干預組，每天分別予艾塞那肽1 μg、2 μg、4 μg/kg（大鼠體重） 注射，多烯磷脂酰膽堿治療組（PDC） 每天予PDC 46 mg/kg（大鼠體重） 注射。NAFLD 模型組及空白組（CON） 予普通生理鹽水注射，以上各組均在大鼠頸部皮下注射。

1.2.3 實驗藥品和試劑 艾塞那肽購自Baxter Pharmaceutical Solutions LLC，多烯磷脂酰膽堿購自賽諾菲安萬特制藥有限公司，瓊脂糖購自美國Invitrogen 生物公司；胰島素試劑盒購自Bio-Swamp 公司，血糖試劑盒購自南京建成生物工程研究所；總RNA 提取試劑盒購自天根公司，多克隆抗體試劑盒購自美國Santa Cruz 公司，相應(yīng)二抗購于中杉金橋公司；引物購自上海英俊生物科技有限公司。

1.3 收集標本

治療4 周和8 周后使用3.6%的水合氯醛，按照每100 g 體重1 mL 麻醉大鼠，大鼠仰臥位固定后，沿劍突下斜行向上刺入2.5～3.0 cm 入心臟取血[16]，離心后取上清液；并留取肝臟勻漿提取上清液，以上標本-86℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測指標

1.4.1 病理 組織于4%的甲醛液中固定后切片、HE 染色觀察大鼠肝臟病理學變化。

1.4.2 生化指標檢測 血糖及肝功能指標測方法為酶法。胰島素檢測采用雙抗體夾心法。

1.4.3 SREBP1、ACCα 及SCD1 mRNA 表達采用RT-PCR 檢測 取肝臟組織提取總RNA，進行PCR 反應(yīng)擴增。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物電泳完成后采集圖像，計算各條帶的熒光強度值，以β-actin 作為內(nèi)參進行標準對照。每組重復試驗3 次。

SERBP1 Primer：A:5'CGTTCGCCATAACCAAG TAGAG 3'，B:5'GGCGATGCTGTACACTGTTGA 3'，產(chǎn)物長度：126 bp；ACCαPrimer：A:5'AGCGCTA CCGTTCCTCTATCAA 3'，B:5'GCTGTAAGAAGCGG ATGTAGTCG 3'，產(chǎn)物長度:118 bp；SCD1 Primer:A:5'CATCGCCAACACCATGGCATT3'，B:5'TCTGGAA CATCATCACCAGCTTCTC3'，產(chǎn)物長度：186 bp；β-actin Primer:A:5'GTGACGAGGCCCAGAGCAAGA G-3'，B:5'ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTGG3'，產(chǎn)物長度：123 bp。

1.4.4 Western blot 檢 測SREBP1，ACCα，SCD1 蛋白表達 取肝臟組織勻漿測定蛋白含量，定量后電泳，切取目標蛋白，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h 后加入多克隆一抗，4℃過夜，洗膜后加入辣根酶標記的二抗孵育，洗滌后與發(fā)光試劑反應(yīng)，洗片后掃描圖像，計算各條帶的灰度值，以β-actin 作內(nèi)參進行標準對照。每組重復試驗3 次。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 進行數(shù)據(jù)分析，定量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析，t檢驗進一步比較兩組間差異，顯著性檢驗標準P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 艾塞那肽治療后NAFLD 大鼠肝臟病理學改變

大鼠肝臟組織HE 染色顯示：HFD 組表現(xiàn)細胞變性及脂肪顆粒沉積；艾塞那肽干預后4 周后，各干預組脂肪顆粒均明顯減少，8 周時改變亦顯著，見圖1。

圖1 肝臟HE 染色變化圖（20×20）Fig.1 The pathological changes of liver by HE staining （20×20）

2.2 艾塞那肽治療后NAFLD 大鼠肝功能改變

2.2.1 艾塞那肽治療4 周、8 周后 艾塞那肽治療NAFLD 大鼠4 周和8 周后，大鼠天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT） 指標明顯降低（P＜0.05），見表1、表2。

2.2.2 胰島素抵抗指數(shù)的變化 艾塞那肽治療4周、8 周后，艾塞那肽三個治療組胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistant index，IRI） 較HFD 組下降（P＜0.05），見圖2。

2.3 觀察艾塞那肽使用前后對NAFLD 大鼠脂肪酸基因表達的影響

2.3.1 SREBP1，ACCα，SCD1 mRNA 表達治療4 周、8 周后，SREBP1 及ACCαmRNA 表達逐漸下降，SCD1mRNA 表達明顯增加（P＜0.05），見圖3、圖4。

2.3.2 SREBP1，ACCα，SCD1 蛋白表達 治療4 周、8 周后，SREBP1、ACCα 蛋白表達逐漸下降（P＜0.05）；SCD1 蛋白表達上升（P＜0.05），見圖5、圖6。

表1 治療4 周后大鼠肝功能比較［U/L，（±s）］Tab.1 Comparison of the liver function indicators after 4 weeks of treatment［U/L，（±s）］

表1 治療4 周后大鼠肝功能比較［U/L，（±s）］Tab.1 Comparison of the liver function indicators after 4 weeks of treatment［U/L，（±s）］

與HFD 組比較，*P ＜0.05；與PDC 組比較，#P ＜0.05。

表2 治療8 周后大鼠肝功能比較［U/L，（±s）］Tab.2 Comparison of the liver function indicators after 8 weeks of treatment［U/L，（±s）］

表2 治療8 周后大鼠肝功能比較［U/L，（±s）］Tab.2 Comparison of the liver function indicators after 8 weeks of treatment［U/L，（±s）］

與HFD 組比較，*P ＜0.05；與PDC 組比較，#P ＜0.05。

圖2 胰島素抵抗指數(shù)比較Fig.2 Comparison of the insulin resistance index

圖3 治療4 周后大鼠SREBP-1,ACCα 及SCD1 mRNA 表達Fig.3 SREBF-1c,ACCα and SCD1 mRNA expression in livers of rats after 4weeks of treatment

圖4 治療8 周后大鼠SREBP-1,ACCα 及SCD1 mRNA 表達Fig.4 SREBF-1c,ACCα and SCD1 mRNA expression in livers of rats after 4weeks of treatment

圖5 治療4 周后大鼠SREBP-1,ACCα 及SCD1 蛋白表達Fig.5 SREBF-1c,ACCα and SCD1 protein expression in livers of rats after 4 weeks of treatment

圖6 治療8 周后大鼠SREBP-1,ACCα 及SCD1 蛋白表達Fig.6 SREBF-1c,ACCα and SCD1 protein expression in livers of rats after 8weeks of treatment

3 討論

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD） 是一種與胰島素抵抗（insulin resistance，IR） 和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，包括一系列的嚴重程度，從簡單的脂肪變性到更高級的形式，非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）[17-18]。NASH 發(fā)生在30%的NAFLD 患者中，它顯著增加了肝硬化的風險[19]。據(jù)預測NAFLD 將成為肝細胞癌的主要危險因素。大量臨床證據(jù)表明，NAFLD與心血管疾病、慢性腎臟病和2 型糖尿病獨立相關(guān)[20]。

目前公認NAFLD 病因研究是1998 年Day[21]提出的二次打擊學說。第一次打擊主要是指肝臟細胞內(nèi)的脂肪顆粒過量積累，而胰島素抵抗可能貫穿于NAFLD 發(fā)病的全過程，是NAFLD 第一次打擊的始動及中心環(huán)節(jié)。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白l(sterolregulatoryelement-bindingprotein-l，SREBP-l)作為脂肪生成轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，其通過參與脂肪酸和甘油三酯合成基因的活化來調(diào)節(jié)脂肪生成的過程[22]。SREBP1 介導脂肪生成相關(guān)甘油三酯合成和積累的表達[23-24]，SREBP1 可導致肝臟中過多的甘油三酯積聚，從而導致NAFLD 的發(fā)生[25]。

乙酰輔酶A 羧化酶α（acetyl-CoA carboxylase alphα，ACCα） 在脂肪酸碳鏈延長酶系的作用下合成長鏈脂肪酸，促進脂肪變性，造成脂肪顆粒在肝臟聚集，從而導致了NAFLD 發(fā)生[26]。硬脂酰輔酶A 去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase1，SCD-1） 是合成單不飽和脂肪酸的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，參與脂肪肝的發(fā)病過程。胰島素抵抗時，SREBP-1過量表達，而SREBP-1 除可以控制脂肪代謝外，也是肝臟中所分泌調(diào)節(jié)脂肪代謝酶ACCα 和SCD-1 的調(diào)節(jié)酶，SREBP-1 的表達升高，會造成肝臟中ACCα 酶的過量表達，促使SCD1 酶表達降低，三個蛋白相互作用，相互影響，導致肝臟脂肪代謝障礙，最終造成非酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展[27]。而加劇脂肪肝進一步發(fā)展的重要因素是氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化損傷[28]。當肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過度堆積到一定程度時，會導致脂質(zhì)過氧化，加速肝細胞損傷，最終發(fā)生肝纖維化和肝細胞死亡。本研究對艾塞那肽治療NAFLD 大鼠的作用進行探討，結(jié)果顯示艾塞那肽治療NAFLD 大鼠4 周及8周后：PDC、ELD、EMD 以及EHD 四個干預組脂肪顆粒均明顯減少、肝功能指標明顯下降，提示艾塞那肽可以明顯改善NAFLD 大鼠肝臟的病理狀態(tài)及肝功能；艾塞那肽三個治療組胰島素抵抗指數(shù)較HFD 組下降明顯（P＜0.05），PDC 組不明顯，提示艾塞那肽可改善胰島素抵抗，而PDC 對改善胰島素抵抗不明顯；艾塞那肽治療后NAFLD 大鼠的SREBP1 及ACCαmRNA 表達逐漸下降（P＜0.05），SCD1mRNA 表達明顯增加（P＜0.05），SCD1mRNA 表達在ELD、EMD、EHD 組呈逐步增加的趨勢，SREBP1mRNA 以及ACCαmRNA 則呈逐步降低的趨勢；SREBP1、ACCα 蛋白表達逐漸下降（P＜0.05），SCD1 蛋白表達上升（P＜0.05）。提示艾塞那肽和PDC 增加SCD1mRNA 和蛋白的表達，降低SREBP1 以及ACCα mRNA 和蛋白的表達，且與艾塞那肽劑量相關(guān)。說明艾塞那肽和PDC 能增加SCD1 酶的活性，降低SREBP1 和ACCα 酶活性。

綜上所述，艾塞那肽可以通過降低NAFLD 大鼠SREBP1 以及ACCα 表達，升高SCD1 表達，降低胰島素抵抗，抑制脂肪變性發(fā)生和脂肪顆粒在肝臟內(nèi)的聚集，可能對NAFLD 大鼠有一定的治療作用，給臨床上尋找治療NAFLD 的有效藥物提供了一條新的思路。