草珊瑚組培快繁技術(shù)研究

姜麗瓊, 李文俊*, 肖前剛, 廖珂靖, 徐志萍, 廖興勇, 劉瓊, 浣杰

1. 成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611130；

2. 山東大學(xué)數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)院，山東 威海 264209

草珊瑚(Sarcandra glabra Nakai)，俗稱滿山香、觀音茶、接骨木、九節(jié)茶等，是金栗蘭科多年生常綠亞灌木，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū)及東南亞等地[1]。草珊瑚是常用中藥材，具有清熱涼血、活血消斑、祛風(fēng)通絡(luò)之功效，臨床上常用于血熱發(fā)斑發(fā)疹、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷等[2]。同時(shí)其形態(tài)秀麗、四季馨香，具有極高的食用及觀賞價(jià)值，草珊瑚適應(yīng)性強(qiáng)，既可制作清雅小巧的盆栽，置于室內(nèi)觀賞，也可用于園林、庭院的綠化點(diǎn)綴[3]。

全國(guó)草珊瑚干品藥材原料的需求量每年達(dá)萬(wàn)噸以上[4]，隨著草珊瑚需求的日益增加和野生資源減少，近年來(lái)在江西、福建、廣西等地開始進(jìn)行人工林下栽培[5]。種苗是草珊瑚擴(kuò)大種植規(guī)模的關(guān)鍵。目前，草珊瑚主要采用播種、分株、扦插等方式進(jìn)行栽培繁殖。種子苗存在變異，幼苗規(guī)格大小不一，而且還受育種時(shí)間、育種環(huán)境和材料多少的限制；硬枝扦插、分株繁殖受育苗時(shí)間、育種環(huán)境和材料多少的限制；而組織培養(yǎng)則不受時(shí)間和空間的限制，繁殖速度快，一年四季都可以批量生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)健康、遺傳特性一致的草珊瑚苗木[6-8]。目前，草珊瑚外植體消毒、接種與初代培養(yǎng)、繼帶與生根培養(yǎng)、煉苗馴化等方面已取得很多研究成果[9-11]，一般采用MS 為基本培養(yǎng)基，本研究比較了MS、1/2MS、B5、ER 培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果，并對(duì)草珊瑚組織培養(yǎng)各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行系統(tǒng)研究，建立草珊瑚組培快繁技術(shù)體系，可為草珊瑚的組培工廠化育苗和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展利用提供技術(shù)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料選自成都市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)研究所科研種植園區(qū)引種的長(zhǎng)勢(shì)良好、健壯、無(wú)病蟲害的草珊瑚優(yōu)良單株，在不同時(shí)期剪取帶腋芽的莖段作為供試材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的處理

在4—5 月、7—8 月、9—10 月分別取帶腋芽的半木質(zhì)化枝條作為外植體，預(yù)處理后置于超凈工作臺(tái)上。將外植體分成頂芽和莖段分別裝入無(wú)菌瓶中，頂芽用0.1%氯化汞浸泡5～6 min，莖段用75%酒精處理30 秒后用0.1%氯化汞浸泡8～10 min，無(wú)菌水沖洗6 遍，用無(wú)菌濾紙吸干水分，剪成帶1～2 個(gè)腋芽的莖段接種于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)。接種后5～7 d 觀察并記錄感染情況，30 d 后統(tǒng)計(jì)感染率與死亡率，各處理重復(fù)3 次。

感染率（%）=感染外植體總數(shù)/接種外植體總數(shù)×100

死亡率（%）=死亡外植體總數(shù)/接種外植體總數(shù)×100

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)

將無(wú)菌外植體分別接種于MS、1/2MS、B5、ER 基本培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基設(shè)置兩種激素配比，分別為0.4 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA 和0.8 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA 先期暗培養(yǎng)，待腋芽萌發(fā)后轉(zhuǎn)置400～800 lx、25 ℃的條件下培養(yǎng)，45 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)其結(jié)果，各處理重復(fù)3 次。

1.2.3 增殖培養(yǎng)

以改良的B5 為基本培養(yǎng)基，分別以6-BA（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L-1），NAA（0.2、0.5 mg·L-1），AC（0、1.0 g·L-1）作為激素配比，蔗糖為3%，共設(shè)置18 個(gè)處理。接種后于25 ℃進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)20 d 左右待新芽長(zhǎng)出，在400～800 lx 下培養(yǎng)，60 d后觀察其生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，每處理重復(fù)3 次。

增殖系數(shù)=單個(gè)莖段繼代一次后增殖總數(shù)/單個(gè)莖段總數(shù)

1.2.4 生根培養(yǎng)

以1/2B5 為基本培養(yǎng)基，添加激素NAA（0.1、0.2 mg·L-1），IBA(0.1、0.3、0.5 mg·L-1），AC（0、1.0 g·L-1）多因子不同配比組合作為生根試驗(yàn)培養(yǎng)基。25 ℃左右，暗培養(yǎng)15 d 左右，待其大部分小苗生根后放到光照強(qiáng)度為500～1 000 lx 培養(yǎng)，60 d 后在移栽洗苗時(shí)統(tǒng)計(jì)生根率和苗高，重復(fù)3 次。

生根率（%）=生根植株總數(shù)/接種植株總數(shù)×100

1.2.5 煉苗及移栽

將瓶苗從組培室移到自然環(huán)境中煉苗7 d 后，洗去培養(yǎng)基，用0.1%多菌靈浸泡15～30 分鐘后進(jìn)行移栽，移栽基質(zhì)為腐殖土、珍珠巖、椰糠、泥土的不同配比組合。每種基質(zhì)移栽50 株草珊瑚苗，移栽后用薄膜覆蓋，移栽后3 d 噴灑1 次殺菌劑后，以后每周用廣譜殺菌劑（70%多菌靈、70%百菌清、70%甲基托布津1 000 倍液交替使用）噴施，90 d 后觀察其生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)成活率。每處理重復(fù)3 次。

成活率（%）=移栽成活組培苗總數(shù)/移栽組培苗總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌株的建立

試驗(yàn)結(jié)果表明，頂芽+嫩莖作為外植體接種后感染率低，但死亡率極高，半木質(zhì)化基部莖段感染率較高，但死亡率低；4—5 月取樣的外植體感染率和死亡率最低，7—10 月取樣接種的外植體感染率和死亡率最高，因此，建立無(wú)菌株的外植體應(yīng)選用4—5 月木質(zhì)化程度較高且較粗壯的半木質(zhì)化枝條的基部莖段。

表 1 草珊瑚不同取樣時(shí)間和接種部位感染率與死亡率一覽表Tab. 1 Infection rate and mortality rate at different sampling times and inoculation sites of Sarcandra glabra

表 2 四種基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)成芽結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab. 2 Statistics results on bud formation induced by four basic culture medium

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)

將無(wú)菌株接種于不同激素配比的4 種基本培養(yǎng)基中進(jìn)行誘芽培養(yǎng)，結(jié)果表明4 種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)草珊瑚出芽。1/2MS 培養(yǎng)基誘導(dǎo)的芽弱，葉色淡，且葉柄與莖段連接處容易產(chǎn)生白色愈傷從而使葉柄斷裂；MS 和ER 培養(yǎng)基中的莖段誘芽率較低，葉柄處容易變黑導(dǎo)致整株變黑死亡；B5 培養(yǎng)基對(duì)草珊瑚誘芽效果較好。因此，草珊瑚最佳誘芽培養(yǎng)基為B5+0.8 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA。

2.3 增殖培養(yǎng)

以不同激素配比的改良B5 誘導(dǎo)無(wú)菌芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，由表3 和圖1 可以看出，草珊瑚在沒(méi)加入活性炭（AC）的培養(yǎng)基中，芽的增殖系數(shù)隨6-BA 的增加而增加，而芽的高度在6-BA 小于4 mg·L-1時(shí)變化不大，當(dāng)濃度大于4 mg·L-1時(shí)，高度則隨6-BA 濃度的增大而變矮，植株葉子泛黃變小且較脆，莖節(jié)變短粗，植株不長(zhǎng)高。由表3 和圖2 可以看出，草珊瑚在加入1 mg·L-1AC 的培養(yǎng)基中，芽的增殖系數(shù)和高度隨6-BA 的增加變化不大，與不加AC 相比，能明顯增加植株的高度，而且植株容易生根，適合生根之前的壯苗培養(yǎng)。綜上所述，AC=0 mg·L-1，B5+3.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA 培養(yǎng)基對(duì)芽的增殖系數(shù)和株高等綜合表現(xiàn)最好，是草珊瑚增殖繼代最佳培養(yǎng)基配方。

表 3 草珊瑚增殖試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab. 3 Statistics results on proliferation test of sarcandra glabra

圖 1 不同增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)草珊瑚增殖系數(shù)Fig. 1 Proliferation coefficient of sarcandra glabra induced by different culture medium

2.4 生根培養(yǎng)

從表4 可以看出，各因數(shù)水平組合間的生根情況無(wú)較大差異，幾乎無(wú)側(cè)根和須根，葉色油綠。隨著NAA、IBA 濃度的增加生根率增加，莖變粗，葉變大。綜合比較，3 組培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根率達(dá)到100%，平均生根數(shù)大于6.5 條，生根質(zhì)量好，生根整齊，根莖較粗，葉較大，所以1/2B5+0.1 mg·L-1NAA+0.8 mg·L-1IBA 培養(yǎng)基為草珊瑚生根培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基。

圖 2 不同增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)草珊瑚株高Fig. 2 Plant height of Sarcandra glabra induced by different culture medium

2.5 煉苗移栽

從表5 可以看出草珊瑚組培苗在4 組基質(zhì)中煉苗移栽成活率最高，成活率達(dá)94%，生長(zhǎng)狀況好，葉大，苗子長(zhǎng)勢(shì)壯。所以4 組腐殖土∶椰糠∶珍珠巖∶泥土=5∶2∶1∶2 組合基質(zhì)為草珊瑚移栽最佳基質(zhì)。

表 4 草珊瑚生根培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab. 4 Statistics results of root culture test of Sarcandra glabra

表 5 草珊瑚煉苗移栽試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab. 5 Statistics results on acclimatization and transplant of Sarcandra glabra

圖 3 草珊瑚組織培養(yǎng)過(guò)程Fig. 3 Tissue culture process of Sarcandra glabra

3 結(jié)論與討論

（1）草珊瑚無(wú)菌株建立的外植體最佳時(shí)間為4—5 月，最佳外植體是從基部長(zhǎng)出的健壯半木質(zhì)化枝條的基部莖段；

（2）草珊瑚增殖培養(yǎng)要求大量元素的量不能太高，B5 是草珊瑚組織培養(yǎng)的最適基本培養(yǎng)基。AC=0 mg·L-1，B5+3.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA 是草珊瑚增殖繼代最佳培養(yǎng)基配方。

（3）草珊瑚繼代周期較長(zhǎng)約2～3 個(gè)月左右，培養(yǎng)最佳溫度為20～25 ℃，最佳光照強(qiáng)度為400～800 LX，pH 值在5.4～6.0 之間。激素6-BA 在芽誘導(dǎo)和增殖中均起關(guān)鍵性作用，隨著6-BA 濃度的增加增殖系數(shù)隨之增加，但當(dāng)濃度增加到大于3.0 mg·L-1時(shí)芽矮成簇不抽高，葉色黃，葉小向下反卷；生長(zhǎng)素NAA 在各個(gè)培養(yǎng)階段中都起重要作用，在增殖培養(yǎng)過(guò)程中NAA 與6-BA 比值決定了草珊瑚長(zhǎng)勢(shì)，苗子的抽長(zhǎng)和木質(zhì)化程度隨之增加而加大；加入活性炭的培養(yǎng)基誘導(dǎo)草珊瑚幾乎無(wú)新芽產(chǎn)生，但能促進(jìn)組培苗的長(zhǎng)高，有利于成簇的芽的抽長(zhǎng)，新長(zhǎng)出來(lái)的葉色為深綠色，富有光澤。

（4）草珊瑚比較容易生根，在繼代培養(yǎng)基中加入活性炭的部分幼苗也會(huì)生根。根的著生部位主要在葉柄與莖段連接處，木質(zhì)化比較高的草珊瑚苗生根早，越靠近基部的莖節(jié)生根較早且根數(shù)多，幾乎無(wú)須根。