鄒順 段李平 許東芳 孫大志

摘 ?要： 針對(duì)日益突出的結(jié)核病（TB）藥物耐藥性問題，對(duì)抗結(jié)核藥物進(jìn)行了合理的修飾，以增強(qiáng)其結(jié)核病治療的效果.以異煙肼（INH）為原料，與不同的異氰酸酯反應(yīng)，成功制備了9種新型的不對(duì)稱取代脲類化合物，這類脲橋結(jié)構(gòu)對(duì)結(jié)核分枝桿菌（MTB）中的半胱氨酸合酶具有抑制作用，合成的產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜（MS）、氫核磁共振譜（1H NMR）等方法進(jìn)行了分析表征.

關(guān)鍵詞： 抗結(jié)核; 半胱氨酸合酶; 脲橋; 合成

中圖分類號(hào)： O 625.67 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ? ?文章編號(hào)： 1000-5137（2020）04-0416-06

Abstract： In view of the increasingly prominent drug resistance of tuberculosis （TB） drugs，the rational structure modification of antituberculosis drugs can improve the efficacy of TB treatment.In this paper，nine novel asymmetric substituted ureas were successfully prepared by reacting isoniazid（INH） with different isocyanates.This kind of urea bridge structure has inhibitory effect on cystine synthase in mycobacterium tuberculosis（MTB）.The synthesized products were confirmed by mass spectrometry（MS） and nuclear magnetic resonance spectroscopy（1H NMR）.

Key words： antituberculosis; cysteine synthase; urea bridge; synthesis

0 ?引 ?言

結(jié)核?。═B）是一種感染了結(jié)核分枝桿菌（MTB）所引起的一種慢性傳染病，它嚴(yán)重危害著人類健康，素有“白色瘟疫”之稱[1-2].目前，世界衛(wèi)生組織宣布TB不僅是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題，也是嚴(yán)重的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和政治問題[3].TB已經(jīng)成為繼艾滋病及缺血性心臟病后，導(dǎo)致發(fā)展中國家成年人病死率較高的又一原因[4].根據(jù)全球各國的TB疫情狀況，2015年10月WHO重新修訂了全球TB高負(fù)擔(dān)國家名單，中國是30個(gè)高負(fù)擔(dān)國家之一[5].

隨著各類臨床常用藥物的使用，MTB的耐藥性也在不斷提高，這就為未來治療埋下了隱患，甚至對(duì)目前的一些治療情況造成了影響[6].耐多藥肺結(jié)核患者與普通肺結(jié)核患者相比，一是傳染危害更大，受感染者一旦發(fā)病即為原發(fā)耐多藥肺結(jié)核，且傳染期更長;二是治療費(fèi)用更高，耐多藥/廣泛耐藥肺結(jié)核（XDR-TB）的治療需要二線抗結(jié)核藥物，治療時(shí)間長達(dá)2～3年之久，治療費(fèi)用大約是普通肺結(jié)核的100倍[7].盡管異煙肼（INH）的耐藥性問題日益嚴(yán)重，但通過對(duì)該化合物進(jìn)行合理的修飾，或許會(huì)得到對(duì)藥敏型和耐藥型的MTB，尤其是對(duì)XDR-TB均有效的新型抗TB藥物.因此，近年來藥物化學(xué)家對(duì)這類化合物一直進(jìn)行著廣泛的研究[8].

隨著MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株基因測序工作完成，蛋白質(zhì)組學(xué)（Pro-teomics）已成為MTB功能基因組學(xué)研究的重要方法[9].ZONG等[10]通過比較XDR-TB臨床分離株與標(biāo)準(zhǔn)菌株MTB（H37Rv）蛋白表達(dá)的差異，得出潛在臨床藥物作用靶點(diǎn)的3個(gè)蛋白質(zhì)：ATP依賴性假定蛋白R(shí)v2623、半胱氨酸合酶和蛋白酶體.其中針對(duì)半胱氨酸合酶，BRUNNER等[11]發(fā)現(xiàn)N，N′-雙取代脲這類化合物能在一定程度上抑制半胱氨酸合酶的活性.

故本文作者采用INH為母體，與芳香異氰酸酯化合生成含有N，N′-雙取代脲這類結(jié)構(gòu)的化合物，根據(jù)不同取代基修飾的芳香異氰酸酯，得到不同取代基修飾的目標(biāo)化合物，如圖1所示.目標(biāo)化合物具有N，N′-雙取代脲這類結(jié)構(gòu)，對(duì)XDR-TB具有一定的抑制作用，在體內(nèi)水解后生成INH，對(duì)H37Rv具有抑制作用，故目標(biāo)化合物應(yīng)是一種對(duì)普通TB與耐藥TB均有效的抗結(jié)核化合物.目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)由液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）和氫核磁共振譜（1H NMR）檢測表征.

1 ?材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

乙腈（CH3CN）、無水乙醇，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;二氯甲烷、石油醚，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司;INH、對(duì)甲苯異氰酸酯、對(duì)三氟甲基苯異氰酸酯、對(duì)甲氧基苯異氰酸酯、異氰酸酯對(duì)氟苯、對(duì)氯苯異氰酸酯、對(duì)溴苯異氰酸酯、3，4-二氯苯異氰酸酯、3，5-二氯苯異氰酸酯、3-吡啶異氰酸酯，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.實(shí)驗(yàn)合成所用主要試劑均為市售分析純級(jí)別，未經(jīng)純化直接使用.

恒溫磁力攪拌器（馳久85-2），上海閔行虹浦儀器廠;手提式紫外分析儀（2FP），上海康禾光電儀器有限公司;熔點(diǎn)測定儀（B-540）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-300），瑞士步琪有限公司;分析天平（BSA224S），德國賽多利斯集團(tuán);質(zhì)譜儀（LCQ Deca），美國Thermo公司;電子天平 （JA2003N），上海精密科學(xué)儀器有限公司.

1.2 目標(biāo)化合物的合成及實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象

目標(biāo)化合物的合成采用化學(xué)實(shí)驗(yàn)合成法.在100 mL干燥的圓底燒瓶中，加入30 mL的乙腈及1.0 g的INH，充分搖蕩后，在恒溫磁力攪拌器上油浴加熱冷凝回流1～2 h.當(dāng)INH完全溶解后，稱量1.0～2.0 g的不同芳基的異氰酸酯（ 加入的物質(zhì)的量稍多于INH），并緩慢滴加至圓底燒瓶中，反應(yīng)過程中觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并記錄.滴加完畢后繼續(xù)油浴加熱回流1～2 h，待溶液冷卻后，抽濾并用乙腈洗滌，烘干稱量，即得到目標(biāo)化合物，并用熔點(diǎn)測定儀測量其熔點(diǎn).加入不同芳基的異氰酸酯，得到產(chǎn)物a～h;當(dāng)芳基取代基為吡啶（即3-吡啶異氰酸酯）時(shí)，得到產(chǎn)物i，如表1所示.根據(jù)反應(yīng)物的不同，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象也各不相同，如表2所示，產(chǎn)物產(chǎn)率都在70%以上，反應(yīng)較為完全.

1.3 目標(biāo)化合物的表征

1.3.1 MS的測定

MS由Thermo LCQ Deca 質(zhì)譜儀測定.接通氮?dú)猓∟2）和氬氣（Ar），設(shè)定N2為7×105 Pa.檢查電源并打開儀器，待質(zhì)譜儀自檢后，選擇Masslynx軟件中的離子模式.先注入調(diào)節(jié)儀器的標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)節(jié)靈敏度和分辨率后，進(jìn)行樣品測定.

1.3.2 1H NMR的測定

首先進(jìn)行樣品的制備，在核磁共振樣品管中放入2～5 mg樣品，并加入0.5 mL氘代氯仿及1～2滴四甲基硅烷（TMS），進(jìn)行測譜，將含樣品的核磁共振管置入核磁共振儀中，測定1H NMR譜圖.

2 ?分析與討論

2.1 LC-MS分析

產(chǎn)物經(jīng)LC分離后得以純化，以純物質(zhì)形式進(jìn)入質(zhì)譜儀，可以充分發(fā)揮質(zhì)譜法的特長，通過MS圖中最高的分子離子峰的質(zhì)荷比與目標(biāo)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量比較，可以初步判定產(chǎn)物是否為目標(biāo)產(chǎn)物.同樣根據(jù)LC圖的出峰數(shù)和各峰面積比可以知道產(chǎn)物的純度.

以產(chǎn)物a為例，結(jié)果如圖2所示.設(shè)計(jì)的目標(biāo)化合物a的相對(duì)分子質(zhì)量為270.26，根據(jù)MS圖（圖2）所示，MS所測樣品的分子離子峰的質(zhì)荷比約為271.12，分子離子峰的質(zhì)荷比與目標(biāo)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量基本相一致.即可初步證明產(chǎn)物即為目標(biāo)化合物a.根據(jù)LC圖（圖3）所示，所合成產(chǎn)物純度較高，雜質(zhì)峰較少，且雜質(zhì)峰面積較小.

依據(jù)此方法分析其他產(chǎn)物的LC-MS結(jié)果，所測所有產(chǎn)物樣品的分子離子峰的質(zhì)荷比與目標(biāo)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量基本都一致，即可初步證明產(chǎn)物即為目標(biāo)化合物.除產(chǎn)物g，h和i，其他所合成產(chǎn)物純度較高，雜質(zhì)峰較少，且雜質(zhì)峰面積較小.產(chǎn)物g，h和i需進(jìn)一步純化降低雜質(zhì)含量，以排除雜質(zhì)對(duì)藥效的影響.

2.2 1H NMR分析

以產(chǎn)物a為例，分析1H NMR譜圖信息（400 MHz，DMSO-d6），化學(xué)位移（δ）為10.66～10.49 （m，1H），8.81 （s，1H），8.79～8.72 （m，2H），8.26 （s，1H），7.88～7.75 （m，2H），7.41～7.29 （m，2H），7.12～7.01 （m，2H），2.23 （s，3H）.根據(jù)產(chǎn)物a的1H NMR圖譜信息，在δ為2.3處譜圖積分為3，對(duì)應(yīng)設(shè)計(jì)目標(biāo)化合物a中苯環(huán)上的甲基氫，在δ為7.12～7.01處積分為2，對(duì)應(yīng)苯環(huán)上靠近甲基的2個(gè)氫，因?yàn)楸江h(huán)上的H的δ在7～8，當(dāng)與供電子基-CH3連接時(shí)，電子云密度增大，δ較小，δ為7.41～7.29應(yīng)為苯環(huán)上另2個(gè)氫.而相應(yīng)地，吡啶環(huán)上的N可視為強(qiáng)吸電子基，使δ偏大，δ為8.79～8.72處積分為2的2個(gè)氫是吡啶環(huán)上靠近N原子的2個(gè)氫，在δ為7.88～7.75處積分為2的2個(gè)氫則是吡啶環(huán)上另2個(gè)氫.δ為10.66～10.49，8.81及8.26處，積分均為1，對(duì)應(yīng)目標(biāo)化合物上脲橋的3個(gè)亞氨基上的氫.

綜合產(chǎn)物a的1H NMR譜圖信息和2.1節(jié)MS信息所得結(jié)論，可以確定所得產(chǎn)物即為設(shè)計(jì)目標(biāo)化合物a.依此分析其他產(chǎn)物，可以確定所有所得產(chǎn)物均為目標(biāo)化合物.

2.3 生物活性測試

在本研究中不作生物活性的詳細(xì)介紹，另在其他文獻(xiàn)中進(jìn)行了藥物活性實(shí)驗(yàn)的分析詳解.藥物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本次合成的9種藥物均有著不亞于常用藥物的藥效，需進(jìn)一步探究臨床效用.

3 ?結(jié) ?論

本實(shí)驗(yàn)得到的INH衍生化合物是INH與一系列異氰酸酯反應(yīng)生成的不對(duì)稱取代脲類化合物.INH作為抗肺結(jié)核藥物已有50多年的歷史，仍具有良好的生物活性，但是抗藥性的產(chǎn)生無疑是一個(gè)亟需解決的問題.因此，近幾十年來，對(duì)INH及其衍生物的合成與應(yīng)用研究從未間斷.在抗藥結(jié)核桿菌與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核桿菌之間的蛋白質(zhì)差異中發(fā)現(xiàn)半胱氨酸合酶這一潛在的靶點(diǎn)，因此，本課題在現(xiàn)有INH藥物的基礎(chǔ)上，在其有效位點(diǎn)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和改進(jìn)，合成了9種新型的N，N′-雙取代的脲類化合物.合成的產(chǎn)物通過熔點(diǎn)測定、MS、1H NMR等手段表征，表明產(chǎn)物即為所設(shè)計(jì)的目標(biāo)化合物.合成的目標(biāo)化合物在生物活性上不亞于常用藥物，并且合成轉(zhuǎn)化率較高.

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（責(zé)任編輯：郁慧，包震宇）