Hepa1-6原位肝癌小鼠模型的構(gòu)建及其IDO1活性和表達的研究

郭磊磊　楊青

【摘 要】目的：建立Hepa1-6原位肝癌小鼠模型，并研究該模型中吲哚胺2，3-雙加氧酶1 （indoleamine 2，3-dioxygenase 1， IDO1）的活性和表達，為研究IDO1在肝癌中的作用及IDO1抑制劑的藥效奠定基礎(chǔ)。方法：培養(yǎng)收集Hepa1-6小鼠肝癌細胞并調(diào)整濃度至2×106/50 μL，將其注射于小鼠肝左葉中，術(shù)后14天處死小鼠，收集血清，解剖并觀察小鼠肝臟腫瘤的形成情況，對腫瘤組織進行HE染色，qPCR法和Western blot法分別檢測腫瘤中IDO1 mRNA和蛋白的表達水平，HPLC法檢測血清中色氨酸和犬尿氨酸的含量。結(jié)果：小鼠肝上形成腫瘤且呈彌漫性生長并發(fā)生肝葉間的轉(zhuǎn)移;肝癌小鼠血清中IDO1活性、腫瘤中IDO1 mRNA和蛋白水平的表達比野生型小鼠的均高。結(jié)論：成功建立Hepa1-6原位肝癌小鼠模型，該模型可用于IDO1功能及IDO1抑制劑藥效學研究。

【關(guān)鍵詞】原位肝癌;吲哚胺2，3-雙加氧酶1（IDO1）;IDO1抑制劑

【中圖分類號】R730.3【文獻標識碼】A【文章編號】1672-3783（2020）06-18--01

肝癌是世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤，預后差，現(xiàn)有的治療效果不盡人意。免疫療法是肝癌治療的新希望，免疫檢查點阻斷療法在肝癌中已有應(yīng)用[1]。吲哚胺2，3雙加氧酶1（indoleamine-2，3-dioxygenase 1，IDO1）是犬尿氨酸代謝通路中的關(guān)鍵限速酶，催化人體必需氨基酸色氨酸（tryptophan，Trp）分解代謝生成L-犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）。它在多種腫瘤里高表達，使腫瘤組織中CD8+ T細胞功能和增殖減弱，F(xiàn)oxp3+ Treg細胞增殖，促進腫瘤細胞生存及腫瘤免疫逃逸等[2]。IDO1被認為是潛在的免疫檢查點，IDO1抑制劑是腫瘤免疫治療的新型候選藥物[3]。目前尚無IDO1抑制劑藥物上市，但多個IDO1抑制劑如Indoximod、Epacadostat、BMS986205等已經(jīng)進入臨床試驗，其中包括BMS986205與PD-1抗體聯(lián)合治療肝癌的一項I期/II期臨床實驗（NCT03695250）[4]。

本研究在建立Hepa1-6原位肝癌小鼠模型的基礎(chǔ)上，研究了該模型血清中IDO1活性和肝腫瘤中IDO1 mRNA與蛋白水平的表達，為研究IDO1在肝癌中的作用及IDO1抑制劑的藥效學奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 主要實驗材料

C57BL/6小鼠（上海杰思捷實驗動物有限公司）、Hepa1-6小鼠肝癌細胞（）、HE染色試劑盒（華安生物）、逆轉(zhuǎn)錄及qPCR試劑盒（諾唯贊）、IDO1抗體（華安生物）等。

1.2 試驗方法

培養(yǎng)收集Hepa1-6細胞并用PBS調(diào)整濃度至2×106/50 μL。脫毛膏褪去小鼠胸腔和腹部的毛并腹腔注射160 μL 5%水合氯醛使小鼠麻醉;沿小鼠劍突剪開1cm的開口，使肝左葉暴露并注入50 μL細胞懸液（含2×106個細胞），棉球按壓止血30 s，器官歸位并縫合創(chuàng)口。術(shù)后1-3 h小鼠蘇醒，正常飼養(yǎng)。術(shù)后14天，小鼠引頸處死，收集血清，解剖并觀察肝腫瘤發(fā)生和發(fā)展情況，收集小鼠肝腫瘤組織。HPLC檢測血清中Kyn和Trp含量，腫瘤組織進行HE染色，提取腫瘤組織總RNA和蛋白，用qPCR法和Western blot法檢測IDO1 mRNA和蛋白表達。具體實驗步驟參照文獻[18]。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Grapsd Prism 5.0進行數(shù)據(jù)處理和圖像繪制，所有實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準誤（±se）表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 造模情況

術(shù)后14天小鼠腹部傷口全部愈合，手術(shù)縫合線全部自動脫落。人道主義處死小鼠，解剖并取出肝臟組織，進行觀察，如圖1所示，棕色部分為肝組織，白色部分為腫瘤組織，腫瘤在肝上大面積彌散性生長，并且已經(jīng)發(fā)生肝葉間的腫瘤轉(zhuǎn)移，小鼠接瘤14天后存活率和成瘤率均為100%。

2.2 組織病理檢查

肝腫瘤組織HE染色結(jié)果如圖2所示，深紫色部分為腫瘤區(qū)（黃色圈區(qū)域），其細胞排列無規(guī)則，細胞核大，染色較深;淺紫色偏紅區(qū)域為正常肝區(qū)，細胞排列整齊，細胞核染色較淺。此外有小片獨立的腫瘤區(qū)出現(xiàn)（黑色箭頭指處），表明肝癌細胞已在肝內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，印證了上述解剖觀察結(jié)果。

2.3 肝腫瘤組織中IDO1 mRNA和蛋白表達水平的檢測

qPCR法檢測肝腫瘤組織中IDO1 mRNA的表達，Western blot法檢測IDO1蛋白的表達，以野生型（WT）小鼠正常肝組織為對照，結(jié)果如圖3所示Hepa1-6原位肝癌小鼠肝腫瘤組織中表達的IDO1 mRNA和蛋白均比WT小鼠的高。

2.4 小鼠血清中IDO1活性的檢測

HPLC法檢測野生型小鼠（WT）和Hepa1-6原位肝癌小鼠血清中Trp和Kyn的濃度，以（Trp/Kyn）*100的比值來定量表示小鼠血清中的IDO1活性。結(jié)果如圖4所示，Hepa1-6原位肝癌小鼠血清中Kyn濃度水平較WT小鼠的高，Trp濃度水平與WT的基本一致，（Kyn/Trp）*100的值變化與Kyn濃度水平變化一致，即Hepa1-6原位肝癌小鼠血清中的IDO1活性高于WT小鼠血清中的。

3 討論

Hepa1-6原位肝癌小鼠血清中IDO1活性是野生型小鼠的2.5倍，本底IDO1活性較高，能較好的反映在給予IDO1抑制劑后小鼠血清中IDO1活性的變化情況。同時，Hepa1-6原位肝癌小鼠血清中IDO1活性和腫瘤中IDO1的表達均高，是研究IDO1與肝癌關(guān)系的良好工具。

總之，本研究在建立Hepa1-6原位肝癌小鼠模型的同時，研究了該模型血清中IDO1活性和肝腫瘤中IDO1 mRNA和蛋白水平IDO1的表達，發(fā)現(xiàn)肝癌小鼠血清中IDO1活性、肝腫瘤中IDO1 mRNA和蛋白水平的表達均較野生型小鼠中的高，為研究IDO1在肝癌中的作用及IDO1抑制劑的藥效學奠定基礎(chǔ)。

參考文獻】

周晨，劉家成，石欽，等. 肝癌分子靶向藥物及免疫抑制劑治療的研究現(xiàn)狀及進展[J]. 中華介入放射學電子雜志，2019，7（3）：243-250.

毛耀南，于萍，任敬慧，等. IDO小分子抑制劑的研究進展[J].實用藥物與臨床，2020，23（2）：186-192.

https：//clinicaltrials.gov/

李天祺，賽音賀西格和楊青. 可用于IDO1抑制劑藥效學研究的KPIC原位胰腺癌小鼠模型的構(gòu)建[J]. 復旦大學學報（醫(yī)學版），2019，46（5）：576-583.