王彥云，孫云，張志蕾，程威，蔣濤(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院&南京市婦幼保健院新生兒篩查中心，南京 210004)

甲基丙二酸血癥(methylmalonic aciduria)是我國(guó)最常見(jiàn)的有機(jī)酸尿癥，發(fā)病年齡各異，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，且缺乏特異性，易漏診或誤診，死亡率和致殘率很高，故而早診斷、早治療顯得尤為重要，目前已被列入歐美國(guó)家的首要篩查病種。二階篩查(second-tier test)理論的提出將新生兒遺傳代謝病篩查的模式從“初次篩查+召回復(fù)查”進(jìn)化為“初次篩查-二階篩查”。2014年，由來(lái)自美國(guó)和12個(gè)歐洲國(guó)家的25位專家共同制定了甲基丙二酸血癥診療指南[1]，明確指出串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)檢測(cè)丙酰基肉堿(propionylcarnitine，C3)等相關(guān)指標(biāo)均缺乏疾病特異性，推薦對(duì)于MS/MS初次篩查陽(yáng)性的樣本采用高效液相色譜質(zhì)譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)合檢測(cè)(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技術(shù)進(jìn)行二階篩查。2016年底，我中心正式將LC-MS/MS技術(shù)應(yīng)用于二階篩查，可以一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)定量檢測(cè)干血斑中甲基丙二酸(methylmalonic acid，MMA)和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的濃度，雖然LC-MS/MS檢測(cè)有規(guī)范化的流程可參考[2-3]，但是其檢測(cè)結(jié)果的cut-off值尚未規(guī)范統(tǒng)一，目前許多實(shí)驗(yàn)室、科研機(jī)構(gòu)使用的cut-off值為梅奧診所提供[3]。然而，不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際外部條件存在一定的差異，且不同種族、不同地域人群的各種代謝物水平之間亦存在差異。因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室在新技術(shù)推廣前，應(yīng)根據(jù)其各自的檢測(cè)條件建立相應(yīng)的cut-off值。本研究通過(guò)前期的數(shù)據(jù)積累，采用ROC曲線確定了本實(shí)驗(yàn)室使用LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)干血斑中MMA和Hcy的cut-off值，以期為各家篩查實(shí)驗(yàn)室提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本 收集2016年1月至2018年8月在我院進(jìn)行MS/MS篩查的丙?；鈮A(propionylcarnitine，C3)、乙?；鈮A(acetylcarnitine，C2)和游離肉堿(free carnitine，C0)3個(gè)指標(biāo)中有1個(gè)及以上指標(biāo)偏高的新生兒初篩干血斑樣本1 015例。另收集同期確診為甲基丙二酸合并同型半胱氨酸血癥的新生兒初篩干血斑樣本16例。本研究通過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(寧婦倫字[2016]107號(hào))，所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2主要儀器與試劑 MS/MS檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)沃特世公司),Agilent 7890A-5975C GC/MS聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司),20ADXR高效液相色譜儀(日本島津公司),phenomenex Kinetex 2.6μ XB-C18 100A色譜柱(美國(guó)菲羅門公司),ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)西門子公司),P800全自動(dòng)生化分析儀及Hcy測(cè)定試劑盒(美國(guó)Roche公司)。MS/MS檢測(cè)試劑盒(美國(guó)珀金埃爾默公司)，有機(jī)酸(氣質(zhì)法)測(cè)定試劑盒(浙江博圣公司)，甲醇、甲酸(美國(guó)西格瑪公司)。

1.3MS/MS檢測(cè)干血斑中C3及其比值的濃度 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4],采用非衍生化MS/MS技術(shù),按照MS/MS檢測(cè)系統(tǒng)及MS/MS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)干血斑中C3并計(jì)算C3/C2、C3/C0比值。C3參考范圍：<3.5 μmol/L；C3/C2參考范圍：<0.2；C3/C0參考范圍：<0.18。

1.4氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4],采用非衍生化GC-MS技術(shù),按照Agilent 7890A-5975C GC/MS聯(lián)用儀及有機(jī)酸(氣質(zhì)法)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)甲基丙二酸血癥患兒隨機(jī)尿?yàn)V紙片樣本中的MMA,MMA參考范圍：0～3.5 μmol/L。

1.5循環(huán)酶法檢測(cè)血清Hcy濃度 按照P800全自動(dòng)生化分析儀及Hcy測(cè)定試劑盒(循環(huán)酶法)說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)甲基丙二酸血癥患兒血清Hcy濃度。Hcy參考范圍：3～50 μmol/L，超出范圍樣品稀釋后復(fù)測(cè)。

1.6LC-MS/MS檢測(cè)干血斑樣本中MMA、Hcy濃度 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4],采用LC-MS/MS技術(shù),按照MS/MS檢測(cè)系統(tǒng)及本實(shí)驗(yàn)室自制試劑檢測(cè)干血斑樣本中MMA、Hcy濃度。根據(jù)梅奧診所提供的LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)干血斑中MMA和Hcy的cut-off值(分別以5.0 μmol/L和15 μmol/L)進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.7MMA生化診斷標(biāo)準(zhǔn)[1,5]尿液MMA顯著升高，血液C3升高或C3/C0、C3/C2升高，Hcy升高的患者，診斷為甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥；尿液MMA顯著升高，血液C3升高或C3/C0、C3/C2升高，Hcy正常的患者，診斷為單純型甲基丙二酸血癥。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。用頻數(shù)分布直方圖觀察MMA和Hcy在干血斑中的分布特征。正態(tài)分布計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。偏態(tài)分布的計(jì)量資料用百分位數(shù)法確定MMA和Hcy在正常新生兒干血斑樣本中的第0.5～99.5百分位界值。結(jié)合正常新生兒和甲基丙二酸血癥患兒的檢測(cè)數(shù)據(jù)，應(yīng)用ROC曲線分析確定MMA和Hcy在干血斑中的cut-off值。

2 結(jié)果

2.1初篩干血斑樣本中MMA和Hcy的濃度 1 015例陰性樣本中MMA和Hcy呈偏態(tài)分布，其中MMA濃度分布區(qū)間為0～5.9 μmol/L，其99.5百分位界值為3.796 μmol/L；Hcy濃度分布區(qū)間為0.3～28.3 μmol/L，其99.5百分位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的數(shù)值為9.498 μmol/L。

2.2確診甲基丙二酸血癥患兒初篩干血斑中LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)室確診16例甲基丙二酸血癥患兒，其初篩干血斑樣本中LC-MS/MS的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表116例確診甲基丙二酸血癥患兒初篩干血斑中LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果

2.3干血斑標(biāo)本中MMA、Hcy濃度結(jié)果 采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較正常新生兒和甲基丙二酸血癥患兒兩組參數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲基丙二酸血癥患兒的MMA和Hcy濃度明顯高于陰性樣本，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(UMMA=8.5，UHcy=23.5，P均<0.05)。

2.4ROC曲線分析MMA及Hcy結(jié)果 針對(duì)1 015例陰性樣本及16例陽(yáng)性樣本，以16例陽(yáng)性標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，1 015例陰性樣本作為對(duì)照組，用ROC曲線分析其篩查甲基丙二酸血癥的臨床效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMA篩查甲基丙二酸血癥的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.999，當(dāng)cut-off值為3.145 μmol/L時(shí)，其敏感性為100%，特異性為99.5%。此外，以1 015例非甲基丙二酸血癥患兒作為對(duì)照組，16例甲基丙二酸血癥患兒作為實(shí)驗(yàn)組，ROC曲線分析Hcy篩查甲基丙二酸血癥的臨床效能，結(jié)果表明，其AUCROC為0.999，當(dāng)cut-off值為7.295 μmol/L時(shí)，其敏感性為100%，特異性為99.3%。

2.5與梅奧診所的cut-off值對(duì)比結(jié)果 本研究中南京地區(qū)人群的MMA和Hcy cut-off值明顯低于梅奧診所提供的cut-off值。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2本實(shí)驗(yàn)室MMA和Hcy檢測(cè)cut-off值與梅奧診所對(duì)比結(jié)果(μmol/L)

3 討論

我國(guó)新生兒遺傳代謝病篩查開(kāi)始于上世紀(jì)八十年代，由于MS/MS技術(shù)的應(yīng)用極大地拓寬了篩查病種，提高了篩查效率。串聯(lián)質(zhì)譜已經(jīng)發(fā)展成為遺傳代謝病篩查中最理想的分析技術(shù)。甲基丙二酸血癥作為我國(guó)最常見(jiàn)有機(jī)酸尿癥[7]，是首要篩查的遺傳代謝病之一，其在南京地區(qū)的發(fā)病率約為1∶11 000，全國(guó)的發(fā)病率暫無(wú)確切的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

長(zhǎng)期以來(lái)，甲基丙二酸血癥的早期發(fā)現(xiàn)主要依賴基于MS/MS技術(shù)的新生兒篩查，篩查指標(biāo)為C3、C2、C0水平及其比值。采用的是基于MS/MS技術(shù)的“初次篩查+召回復(fù)查”模式。二階篩查技術(shù)是在初次篩查技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的準(zhǔn)確性更高的一種篩查技術(shù)，是在原血片基礎(chǔ)上檢測(cè)目標(biāo)疾病的生化診斷指標(biāo)而不是篩查指標(biāo)，以提高目標(biāo)疾病檢出率，降低假陽(yáng)性率和避免漏篩。2004年，針對(duì)新生兒遺傳代謝病篩查首次提出了“二階篩查”的概念[8]。2007年，意大利學(xué)者開(kāi)始嘗試應(yīng)用LC-MS/MS技術(shù)定量分析干血濾紙片中甲基丙二酸血癥等遺傳代謝病的特異性診斷指標(biāo)以進(jìn)行二階篩查[9]，包括MMA、甲基枸櫞酸、3-羥基丙酸、異戊酸、乙基丙二酸等。該研究結(jié)果表明，對(duì)甲基丙二酸血癥MS/MS初次篩查陽(yáng)性樣本進(jìn)行原血片二階篩查，使陽(yáng)性預(yù)測(cè)值從5.2%提高至20%。2010年，美國(guó)梅奧診所Turgeon等[3]對(duì)LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，使每個(gè)樣本檢測(cè)時(shí)間僅需要3 min，并通過(guò)200份陽(yáng)性樣本的研究，初步制定了LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)干血濾紙片中MMA、Hcy等相關(guān)特異性指標(biāo)的cut-off值。以上研究均表明，基于LC-MS/MS的二階篩查技術(shù)具有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，且前國(guó)內(nèi)開(kāi)展二階篩查的研究報(bào)道較少。

新技術(shù)可以引進(jìn)，但是cut-off值不能照搬。不同地域、不同人群的指標(biāo)濃度可能存在差異，因此實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展新項(xiàng)目時(shí)必須制定本實(shí)驗(yàn)室的參考范圍或cut-off值。傳統(tǒng)新生兒篩查檢測(cè)項(xiàng)目，如促甲狀腺素、苯丙氨酸、17α羥孕酮等，多選取數(shù)據(jù)分布的第0.5和99.5百分位界值作為上、下參考限的取值[10-11]。ROC曲線法是能夠全面并準(zhǔn)確評(píng)價(jià)診斷試驗(yàn)的有效工具，且能確定檢測(cè)的最佳閾值。但是截止到目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于二階篩查的報(bào)道非常少，更無(wú)二階篩查指標(biāo)cut-off值建立的研究和文獻(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，MMA和Hcy兩指標(biāo)的99.5百分位界值與ROC曲線分析得到的cut-off值不一致，且99.5百分位界值均大于ROC曲線制定的cut-off值，鑒于甲基丙二酸血癥一旦漏篩后果嚴(yán)重，篩查要求盡量避免漏篩，我們認(rèn)為以ROC曲線制定的cut-off值作為召回患兒的標(biāo)準(zhǔn)更為可靠。但是，當(dāng)新生兒該指標(biāo)超過(guò)cut-off值時(shí)，不能立即診斷為異常，仍然需要考慮召回復(fù)查并進(jìn)一步加以明確。

此外，與美國(guó)梅奧診斷提出MMA的cut-off值為5.0 μmol/L相比，南京地區(qū)人群MMA的cut-off值(MMA：3.145 μmol/L)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)外的人群，進(jìn)行數(shù)據(jù)比較后的結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明二階篩查新技術(shù)引進(jìn)后不能盲目的直接借調(diào)參考值或cut-off值，新技術(shù)引進(jìn)后必須盡快確定適應(yīng)于當(dāng)?shù)厝巳汉驮搶?shí)驗(yàn)室的cut-off值。

必須指出，足夠的陽(yáng)性樣本量是如實(shí)反應(yīng)試驗(yàn)準(zhǔn)確性、排除機(jī)會(huì)干擾的保證，因此ROC曲線在實(shí)際應(yīng)用中要求有一定數(shù)量的陽(yáng)性樣本，最好陽(yáng)性樣本量能大于30例。本中心開(kāi)展LC-MS/MS檢測(cè)時(shí)間尚短，積累的陽(yáng)性樣本量有限，隨著后續(xù)更多陽(yáng)性樣本的積累和納入，該cut-off值可以繼續(xù)利用ROC曲線進(jìn)一步調(diào)整。此外，本研究目的僅僅是在于給其他篩查中心制定該實(shí)驗(yàn)室的cut-off值提供一種可靠的方法，而不是推廣本研究中的參考范圍。