調(diào)控AQP-4蛋白治療大鼠腦積水的效果

?? 吳劍　李秋平 王占祥　胡凡　齊飚　張菲

【摘要】 目的：研究通過(guò)調(diào)控AQP-4蛋白治療大鼠腦積水。方法：選取雄性成年（周齡8周）SD大鼠80只，體重（250±20）g，隨機(jī)分成四組，分別為手術(shù)組、假手術(shù)組、陰性干預(yù)組、陽(yáng)性干預(yù)組，各20只。手術(shù)組、陽(yáng)性干預(yù)組、陰性干預(yù)組都以向大鼠腦室內(nèi)注射3%滅菌高嶺土生理鹽水混懸液成功建立腦積水模型，假手術(shù)組的大鼠則為向腦室內(nèi)注射生理鹽水。造模第8天，對(duì)手術(shù)組和假手術(shù)組不行任何處理，對(duì)陰性干預(yù)組予以腹腔注射黃體酮，對(duì)陽(yáng)性干預(yù)組予以腹腔注射睪酮（兩種藥物用法用量均為1次/d，用量為：8 mg/kg給藥持續(xù)2周）。第22天時(shí)給所有大鼠行MRI檢查，然后處死大鼠收集腦組織，行RT-PCR、Western-blot檢測(cè)。結(jié)果：（1）MRI結(jié)果顯示陽(yáng)性干預(yù)組大鼠腦室擴(kuò)大積水現(xiàn)象較陰性干預(yù)組小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（2）RT-PCR結(jié)果顯示陽(yáng)性干預(yù)組AQP-4 mRNA較陰性干預(yù)組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（3）Western-blot檢測(cè)顯示陽(yáng)性組大鼠的AQP-4蛋白表達(dá)較陰性組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：AQP-4蛋白的表達(dá)水平可影響腦積水進(jìn)展，通過(guò)上調(diào)AQP-4蛋白的表達(dá)可能對(duì)腦積水的進(jìn)展起到抑制作用。

【關(guān)鍵詞】 腦積水 AQP-4蛋白 睪酮 黃體酮

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.16.004 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2020）16-000-04

Effect of Regulating AQP-4 Protein on Hydrocephalus in Rats/WU Jian， LI Qiuping， WANG Zhanxiang， HU Fan， QI Biao， ZHANG Fei. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（16）： -12

[Abstract] Objective： To study the treatment of hydrocephalus in rats by regulating AQP-4 protein. Method： A total of 80 male adult （8 weeks old） Sprague-Dawley （SD） rats with body weight of （250±20） g were randomly divided into four groups， including operation group， sham operation group， negative intervention group and positive intervention group. The operation group， the positive intervention group and the negative intervention group all successfully established hydrocephalus model by injecting 3% sterile kaolin normal saline suspension into the rat brain chamber， while the rats in the sham operation group were injected normal saline into the brain chamber. On the 8th day of modeling， the operation group and the sham operation group were not given any treatment. The negative intervention group was given Progesterone by intraperitoneal injection， and the positive intervention group was given Testosterone by intraperitoneal injection （the dosage of both drugs was once a day， and the dosage was 8 mg/kg for 2 weeks）. On the 22nd day， all rats were examined by MRI， and then killed to collect brain tissue for RT-PCR and Western-blot. Result： （1） MRI results showed that the hydrocephalus in the positive intervention group was smaller than that in the negative intervention group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. （2） The results of RT-PCR showed that AQP-4 mRNA in the positive intervention group was higher than that in the negative intervention group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. （3） Western-blot showed that AQP-4 protein expression in the positive group was higher than that in the negative group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： the expression level of AQP-4 protein can affect the progression of hydrocephalus， and up regulating the expression of AQP-4 protein may inhibit the progression of hydrocephalus.

[Key words] Hydrocephalus AQP-4 protein Testosterone Progesterone

First-authors address： Xiamen Branch， Zhongshan Hospital， Fudan University， Xiamen 361015， China

腦積水是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ顼B腦腫瘤、腦室出血、顱內(nèi)感染等）影響腦脊液循環(huán)通路，導(dǎo)致了腦脊液過(guò)多蓄積于腦室內(nèi)所引起的疾病[1]。通過(guò)動(dòng)物腦積水實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯堪l(fā)現(xiàn)：腦室周?chē)拿}絡(luò)叢、室管膜、膠質(zhì)細(xì)胞上，都發(fā)現(xiàn)AQP-4蛋白的表達(dá)出現(xiàn)明顯升高，且隨著AQP-4蛋白表達(dá)的提高，腦積水的相應(yīng)臨床癥狀有所改善[2-3]。這些研究提示AQP-4蛋白的表達(dá)與腦積水的病程進(jìn)展有關(guān)。AQP-4蛋白是一種調(diào)節(jié)水分的選擇通透性的蛋白廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，AQP-4蛋白主要起到了調(diào)節(jié)腦組織水分代謝的作用[4]，AQP-4蛋白主要有兩種亞型：M1型和M23型，其可增強(qiáng)細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，在腦細(xì)胞水腫時(shí)有利于水分清除[5]。調(diào)控AQP-4蛋白在腦出血后腦細(xì)胞水腫、顱腦損傷的研究開(kāi)展較多，并有一些觀點(diǎn)認(rèn)為降低AQP-4表達(dá)能降低腦出血后腦細(xì)胞水腫[6]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)AQP-4和GFAP的基因、蛋白表達(dá)，從分子學(xué)水平探索腦積水發(fā)生發(fā)展過(guò)程中AQP-4對(duì)腦脊液生成及清除所產(chǎn)生的作用，并通過(guò)加以藥物睪酮、黃體酮進(jìn)行干預(yù)對(duì)照，探究上調(diào)AQP-4蛋白表達(dá)治療腦積水的可能性，為調(diào)控AQP-4蛋白的表達(dá)來(lái)治療干預(yù)腦積水的進(jìn)展提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 一般材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：取健康雄性SD大鼠80只，體重為（250±20）g，鼠齡為8周，由廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2008-0003（廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。采用隨機(jī)分組法分為四組，分別為手術(shù)組、假手術(shù)組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組，各組體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立和給藥干預(yù)方法 （1）麻醉固定消毒：取雄性SD大鼠，根據(jù)各鼠體重計(jì)算麻藥（10%水合氯醛）使用量（300 mg/kg），腹腔注射麻醉，嚴(yán)格消毒鋪巾備皮，將大鼠頭部固定于大鼠腦立體定位儀。（2）體位與暴露：取大鼠前至眉弓中點(diǎn)，后近対耳線，頭頂正中切口，沿著正中線切開(kāi)頭皮約1 cm，鈍性分離皮下組織，暴露前囟。穿刺點(diǎn)定位于：前囟后0.8 mm，中線旁開(kāi)1.6 mm，以牙科鉆鉆孔直到硬腦膜。（3）入路與注射：手術(shù)組、陽(yáng)性干預(yù)組、陰性干預(yù)組三組的大鼠均在腦室內(nèi)注射3%高嶺土混懸液，具體方法為：持微量進(jìn)樣器吸取3%滅菌高嶺土生理鹽水混懸液30 μl，固定于立體定位儀上，連接微量注射泵控制端，垂直進(jìn)針刺破硬膜后繼續(xù)進(jìn)入4.0 mm，調(diào)節(jié)微量注射泵以10 μl/min的速率緩緩注入，注射完之后骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮。假手術(shù)組則在大鼠腦室內(nèi)則注射生理鹽水。（4）陽(yáng)性干預(yù)組于手術(shù)后第8天開(kāi)始腹腔注射睪酮，陰性干預(yù)組于手術(shù)后第8天開(kāi)始腹腔注射黃體酮，用法：睪酮：1次/d，用量為8 mg/kg，給藥持續(xù)2周。黃體酮：1次/d，用量為8 mg/kg，給藥持續(xù)2周。其余兩組不做任何處理。所有大鼠術(shù)后第22天進(jìn)行MRI檢測(cè)，之后處死取腦組織標(biāo)本。

1.2.2 MRI檢查 實(shí)驗(yàn)第22天，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，行MRI檢測(cè)，1 mm為層間距進(jìn)行掃描，分別照射T1和T2加權(quán)成像。側(cè)腦室指數(shù)通過(guò)T2加權(quán)成像計(jì)算。MRI-T2參數(shù)如下：TR=5 000 ms，TE=50 ms，視野（FOV）=5.0 cm×5.0 cm，矩陣：256×256，厚度：1 mm。

1.2.3 腦組織取材及測(cè)量腦組織含水量 大鼠行MRI檢查后，以10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射深度麻醉，取頭皮針插入左心室進(jìn)行生理鹽水及4%多聚甲醛灌注。完后將大鼠斷頭，咬骨鉗咬除顱骨冰上迅速解剖剝?nèi)∧X組織。沿中線切開(kāi)鼠腦，一側(cè)大腦用為Western-blot檢測(cè)，另一側(cè)以視交叉為界切開(kāi)，前半腦做RT-PCR檢測(cè)[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型一般觀察

MRI顯示，手術(shù)組、陽(yáng)性干預(yù)組及陰性干預(yù)組在造模3周后均出現(xiàn)不同程度腦室擴(kuò)大，假手術(shù)組則未出現(xiàn)明顯腦室擴(kuò)大，陽(yáng)性干預(yù)組相對(duì)于陰性干預(yù)組，腦室擴(kuò)大程度較輕，相對(duì)于手術(shù)組，腦室擴(kuò)大程度也較輕。

2.2 假手術(shù)組與手術(shù)組比較

根據(jù)觀察側(cè)腦室體積發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組未形成腦積水，腦室系統(tǒng)幾乎辨認(rèn)不出，手術(shù)組均形成腦積水，MRI上可見(jiàn)其腦室擴(kuò)大變形，皮層受壓變薄，腦室周?chē)M織水腫，第三腦室、第四腦室、蛛網(wǎng)膜下腔也不同程度擴(kuò)大。室周白質(zhì)明顯變?。▓D1）;假手術(shù)組側(cè)腦室體積為（16.8±3.1）mm，手術(shù)組側(cè)腦室體積為（38.7±3.3）mm，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 陽(yáng)性干預(yù)組與陰性干預(yù)組比較

MRI顯示，陽(yáng)性干預(yù)組大鼠腦室增大程度相對(duì)較輕，腦組織受壓不明顯;陰性干預(yù)組側(cè)腦室擴(kuò)大明顯，皮層受壓變薄，腦室周?chē)M織水腫也明顯。第三腦室、第四腦室、蛛網(wǎng)膜下腔也不同程度擴(kuò)大（圖2）;陽(yáng)性干預(yù)組側(cè)腦室體積為（9.8±2.4）mm，陰性干預(yù)組側(cè)腦室體積為（44.2±3.1）mm，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 RT-PCR檢測(cè)

2.4.1 手術(shù)組與假手術(shù)組比較 RT-PCR結(jié)果顯示假手術(shù)組AQP-4mRNA表達(dá)水平為0.76±0.03，手術(shù)組AQP-4 mRNA表達(dá)水平為0.37±0.03，手術(shù)組較假手術(shù)組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=42.647，P<0.05），見(jiàn)圖3。

2.4.2 陽(yáng)性干預(yù)組與陰性干預(yù)組比較 RT-PCR結(jié)果顯示陽(yáng)性干預(yù)組AQP-4 mRNA表達(dá)水平為0.76±0.03，陰性干預(yù)組AQP-4 mRNA表達(dá)水平為0.31±0.03，陽(yáng)性組較陰性組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=33.714，P<0.05），見(jiàn)圖4。

2.5 Western-blot檢測(cè)

2.5.1 手術(shù)組與假手術(shù)對(duì)組比較 Western-blot條帶灰度值分析結(jié)果顯示，手術(shù)組大鼠的AQP-4蛋白表達(dá)水平為1.12±0.02，假手術(shù)組表達(dá)水平2.08±0.02，手術(shù)組較假手術(shù)組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=30.544，P<0.05），見(jiàn)圖5。

2.5.2 陽(yáng)性干預(yù)組與陰性干預(yù)組比較 Western-blot條帶灰度值分析結(jié)果顯示，陽(yáng)性組干預(yù)的AQP-4蛋白表達(dá)水平為2.18±0.02，陰性干預(yù)組的AQP-4蛋白表達(dá)水平為1.12±0.02，陽(yáng)性干預(yù)組中AQP-4表達(dá)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=29.322，P<0.05），見(jiàn)圖6。

3 討論

腦積水常見(jiàn)的病因主要是腦脊液分泌過(guò)多、腦脊液循環(huán)通路受阻、腦脊液吸收障礙。這些因素導(dǎo)致腦脊液在腦室系統(tǒng)內(nèi)過(guò)分積聚[8]，影響腦脊液循環(huán)的主要因素有：顱內(nèi)靜脈壓、血腦屏障間的膠體滲透壓、腦脊液壓力差及腦室周?chē)夜苣ぜ?xì)胞的吸收[9]。腦積水患者的腦組織因?yàn)樗智宄系K，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)積水蓄積，形成細(xì)胞性腦水腫，進(jìn)而導(dǎo)致血管壁細(xì)胞內(nèi)皮緊密結(jié)構(gòu)破壞，形成血管源性腦水腫，進(jìn)而破壞血腦屏障，加重腦組織水腫[10]。

腦積水的治療手段目前仍然以腦室-腹腔分流術(shù)、第三腦室造瘺術(shù)等外科手術(shù)治療為主[11-13]，這些相關(guān)治療手段尚不能從根本上改變腦積水發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。

AQP-4是目前被研究最多的一種水通道蛋白，也是腦組織中含量最豐富的水通道蛋白。其能高效地介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，是控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織內(nèi)含水量的重要蛋白，很多研究證明AQP-4蛋白可以影響腦水腫的消除，直接影響到腦脊液循環(huán)[2，4，14]。AQP-4蛋白在大腦內(nèi)的表達(dá)主要位于室管膜上皮細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、脈絡(luò)叢細(xì)胞等處，這些部分的細(xì)胞主要位于蛛網(wǎng)膜附近，與腦脊液接觸密切，對(duì)腦脊液的生成與吸收產(chǎn)生了重要的調(diào)節(jié)作用[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，在腦積水合并顱內(nèi)壓升高的大鼠模型中，AQP-4在皮層膠質(zhì)細(xì)胞及腦脊液中的表達(dá)出現(xiàn)明顯升高[17]。Mao等[18]在研究高嶺土誘導(dǎo)腦積水小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，AQP-4 mRNA在大腦頂葉和海馬區(qū)有明顯增加，這可能是由于血管外周的AQP-4表達(dá)在大腦頂葉更容易被激活，且大腦頂葉和海馬區(qū)含水量較別的區(qū)域減少。Guo等[19]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)AQP-4 siRNA沉默AQP-4表達(dá)后，大鼠腦積水癥狀明顯加重，表明AQP-4可以延緩大鼠腦積水的病程進(jìn)展。Schmidt等[20]在研究犬腦積水模型時(shí)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AQP-4蛋白升高時(shí)，實(shí)驗(yàn)犬的腦積水癥狀出現(xiàn)緩解，甚至可以降低后期行腦室分流術(shù)的概率，表明AQP-4蛋白對(duì)降低腦室內(nèi)多余水分蓄積起到積極的作用。Leandro等[21]在人類(lèi)腦積水病例研究時(shí)發(fā)現(xiàn)AQP-4蛋白在腦脊液中的含量出現(xiàn)明顯增高，可能是腦積水病理進(jìn)展中室管膜細(xì)胞上的AQP-4蛋白表達(dá)增多，并有部分剝離到腦脊液中引起的。有研究通過(guò)對(duì)患者腦脊液中的AQP-4蛋白進(jìn)行的ELISA定量分析，還發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組，患有交通性腦積水的患者腦脊液中AQP-4蛋白含量的增高程度甚至大于阻塞性腦積水中AQP-4蛋白的增高程度。有膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用NO誘導(dǎo)提高了AQP-4的表達(dá)，并改變膠質(zhì)細(xì)胞的滲透壓，減輕了腦細(xì)胞水腫，這或許是緩解腦積水的有利作用機(jī)制[22]。Eide等[23]研究正常顱內(nèi)壓腦積水發(fā)現(xiàn)，其膠質(zhì)細(xì)胞足突上AOP-4表達(dá)水平下降，且其下降程度與腦積水癥狀嚴(yán)重程度呈正比。

Gu等[24]在使用膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，加入睪酮后，使膠質(zhì)細(xì)胞的AQP-4蛋白表達(dá)增加。在研究腦外傷引起腦水腫時(shí)候，發(fā)現(xiàn)性激素類(lèi)藥物（睪酮、黃體酮）腹腔注射給藥后能很好地透過(guò)血腦屏障，在腦組織內(nèi)發(fā)揮藥效[25]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，睪酮上調(diào)了大鼠腦積水模型腦組織AQP-4蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)和Western-blot檢測(cè)在基因和蛋白水平均驗(yàn)證了其作用。并且睪酮通過(guò)上調(diào)AQP-4蛋白的表達(dá)，減輕了大鼠模型腦積水的嚴(yán)重程度，這說(shuō)明上調(diào)AQP-4蛋白表達(dá)，可以對(duì)減輕大鼠腦積水產(chǎn)生影響，在腦積水的情況下，上調(diào)AQP-4蛋白表達(dá)，可能通過(guò)增大腦組織對(duì)水分的清除率，減輕了腦積水的作用。MRI檢查結(jié)果提示，睪酮不能完全阻止動(dòng)物模型腦積水的進(jìn)展，但能在腦積水進(jìn)展過(guò)程中起到緩解作用，這也驗(yàn)證了睪酮通過(guò)上調(diào)AQP-4蛋白的表達(dá)，可以產(chǎn)生緩解和阻止腦積水發(fā)生發(fā)展的重要作用。相對(duì)應(yīng)的，筆者實(shí)驗(yàn)表明，黃體酮下調(diào)了AQP-4蛋白的表達(dá)，沒(méi)有能起到緩解大鼠腦積水進(jìn)展的作用。經(jīng)過(guò)睪酮干預(yù)后，大鼠腦積水癥狀比經(jīng)過(guò)黃體酮干預(yù)的大鼠腦積水癥狀較輕，證明睪酮對(duì)腦積水的進(jìn)展起到了緩解作用。AQP-4蛋白表達(dá)增高后，對(duì)應(yīng)的大鼠腦積水的水平相對(duì)較輕，大鼠腦組織含水量相對(duì)降低，腦室體積相對(duì)變小。睪酮通過(guò)干預(yù)AQP-4蛋白，上調(diào)其在腦組織中的表達(dá)，延緩了腦積水的生成與發(fā)展，對(duì)腦積水有一定治療作用，黃體酮?jiǎng)t相反。

本實(shí)驗(yàn)研究說(shuō)明上調(diào)AQP-4蛋白的表達(dá)，能一定程度上改善了腦積水的進(jìn)展，上調(diào)AQP-4蛋白表達(dá)對(duì)大鼠腦積水有治療作用。

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（收稿日期：2020-04-08） （本文編輯：郎序瑩）