天麻蜜環(huán)菌選擇性共生機(jī)理研究進(jìn)展

楊林 王傳華 劉盼盼 周斌

摘要：天麻（Gastrodia elata Bl）具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，已被醫(yī)學(xué)和藥學(xué)界廣泛關(guān)注，其食藥用價(jià)值正不斷地被研究認(rèn)識(shí)和開發(fā)利用。通過對(duì)天麻與蜜環(huán)菌生物種的共生關(guān)系進(jìn)行綜述，以期為天麻栽培育種提供參考。

關(guān)鍵詞：天麻;蜜環(huán)菌;共生機(jī)制

中圖分類號(hào)：S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200815005

收稿日期：2020-06-30

基金項(xiàng)目：銅仁市科技局項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2017TRS60223）;國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：31570543）

作者簡介：楊林（1986-），男，碩士。研究方向：食用藥用真菌;通訊作者王傳華。

天麻（Gastrodia elata Bl.）為蘭科（Orchidaceae）多年生共生（Symbiosis）草本植物，是傳統(tǒng)名貴中藥，含豐富的多糖、天麻素、苷類、甾醇等活性物質(zhì)，具有防癌、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗衰老、降低血糖等效果。天麻自身無光合作用，需從入侵的蜜環(huán)菌中獲取營養(yǎng)物質(zhì)而生長發(fā)育[1]。其種子的萌發(fā)，需從紫箕小菇（Mycena osmuudicola Lange）、蘭小菇（Mycena orchidicola）等共生萌發(fā)菌中吸收營養(yǎng)。而天麻種存在 6個(gè)遺傳性狀不穩(wěn)定的變型，包括毛天麻（G.elata BL.f. pilifera）、綠天麻（G.elata BL. f. viridis）、烏天麻（G.elata BL. f. glauca）、松天麻（G.elata BL. f.alba）、紅天麻（G.elata B1.f.elata）和黃天麻（G.elata BL. f.falvida）[2，3]，其中烏天麻和紅天麻的利用價(jià)值最高[3]。

蜜環(huán)菌屬真菌（Armillaria（Fr.：Fr.）Staude）真菌隸屬擔(dān)子菌亞門（Basidomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae），其中部分種具有很高的食藥用價(jià)值。目前全球已鑒定出40多個(gè)生物種[4];我國已鑒定出14個(gè)有環(huán)的蜜環(huán)菌生物種和1個(gè)無環(huán)的蜜環(huán)菌（假蜜環(huán)菌），但僅有5個(gè)生物種A. gallica（高盧蜜環(huán)菌）、A. jezoensis（北海道蜜環(huán)菌）、A. sinapina（芥黃蜜環(huán)菌）和A. singula（單生蜜環(huán)菌）、A. solidipes（奧氏蜜環(huán)菌）能與天麻實(shí)現(xiàn)有效共生[5]，而有效共生的蜜環(huán)菌生物種對(duì)同種天麻具有不同侵染性，使得蜜環(huán)菌生物種與天麻間的共生關(guān)系存在選擇性。加之各蜜環(huán)菌生物種子實(shí)體和蜜環(huán)菌索的形態(tài)特征非常相似，而成為天麻栽培和產(chǎn)量中遇到的實(shí)際困難。

20世紀(jì)60年代以來，我國學(xué)者在天麻有性繁殖[6，7]、天麻生物學(xué)特性[8]、繁殖[6]、分類[2]、雜交育種[9]等方面研究取得了一定進(jìn)展。出版了《天麻栽培學(xué)》專著[3]，實(shí)現(xiàn)了天麻的人工栽培。建立了部分天麻變型的高效液相指紋圖譜[10]。在蜜環(huán)菌入侵機(jī)制與天麻防御、消化、吸收過程等方面也進(jìn)行一定研究[11-14]，確認(rèn)了蜜環(huán)菌是天麻的主要營養(yǎng)來源;發(fā)現(xiàn)了天麻與蜜環(huán)菌之間包含著寄生、共生和反寄生3種關(guān)系[14]及正常生理侵染和病理侵染2種狀況[11];初步說明了密環(huán)菌種與天麻種之間存在選擇性[5，15，16]。綜合各方面的研究，蜜環(huán)菌生物種對(duì)天麻種的毒性、致病性等方面確實(shí)存在顯著差異。但其共生選擇性機(jī)制目前已取得相應(yīng)進(jìn)展，從而有望將成為我國天麻與其共生蜜環(huán)菌種的科學(xué)合理組合配種有效依據(jù)，也將突破我國菌農(nóng)獲得優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)天麻的一道技術(shù)屏障?，F(xiàn)就目前天麻與蜜環(huán)菌的共生基礎(chǔ)特性做如下綜述。

1蜜環(huán)菌生物種菌索發(fā)育的研究

通過多年的研究，明確了蜜環(huán)菌以菌索形態(tài)侵染天麻，而天麻則同化蜜環(huán)菌而獲得營養(yǎng)[17]，蜜環(huán)菌菌株的生長速度與天麻產(chǎn)量呈正相關(guān)，蜜環(huán)菌的生長速度與菌材種類有密切關(guān)系[18]。菌索的生長和發(fā)育受碳源、氮源、無機(jī)營養(yǎng)[19]、維生素[20]、有機(jī)生長因子[21]、酚類物質(zhì)[22]、植物提取液、某些氨基酸[23]、礦質(zhì)營養(yǎng)狀態(tài)等因素的影響，鉀離子、有機(jī)物質(zhì)[24]、松樹皮混合肥[25]能夠刺激其生長，高氮和磷則抑制其生長[24]。Garraway等[26]的研究也認(rèn)為蜜環(huán)菌的生長發(fā)育受其生理和生物化因素影響。而Garrett[27]首次通過純培養(yǎng)研究了蜜環(huán)菌菌索的誘導(dǎo)，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)蜜環(huán)菌產(chǎn)生菌索與營養(yǎng)因素有關(guān)。在菌種間的關(guān)系方面，曾春函等[28]采用8種密環(huán)菌兩兩組合培養(yǎng)研究蜜環(huán)菌菌索的相互作用，發(fā)現(xiàn)部分菌種存在相互拮抗作用，部分組合菌種菌索彼此出現(xiàn)“遠(yuǎn)離”或“靠近”現(xiàn)象，同時(shí)兩兩組合在促進(jìn)菌索發(fā)育速度存在明顯差異。因此可以推論營養(yǎng)、環(huán)境、遺傳是影響蜜環(huán)菌生長發(fā)育的關(guān)鍵因素。蜜環(huán)菌生物種對(duì)不同的天麻種具有不同的侵染性，是使蜜環(huán)菌生物種與天麻種之間存在選擇共生性的基礎(chǔ);蜜環(huán)菌生物種之間具有拮抗效應(yīng)和互交不育性，也是影響天麻產(chǎn)量的重要因素。同時(shí)許多研究[29-31]也支持不同蜜環(huán)菌菌種是影響天麻品質(zhì)的重要因素。

2蜜環(huán)菌生物種侵染天麻的組織學(xué)過程研究

蜜環(huán)菌侵入天麻首先需要形成菌索，菌索附著在天麻表皮，由菌索長出菌絲，然后菌絲以機(jī)械力量和分泌化學(xué)物質(zhì)[32，33]穿透到天麻皮層，菌絲侵入皮層最內(nèi)層細(xì)胞后，以菌絲的形式沿著皮層細(xì)胞成束地向四周擴(kuò)散[34，35]，同時(shí)菌絲釋放漆酶等化學(xué)物質(zhì)，而漆酶的產(chǎn)生伴隨菌索的出現(xiàn)而出現(xiàn)[32];在此過程中應(yīng)該是，蜜環(huán)菌產(chǎn)生的相應(yīng)酶類首先消化天麻皮層細(xì)胞，被消化了的皮層細(xì)胞逐漸形成內(nèi)吞管狀結(jié)構(gòu)，在此過程中天麻收到皮層細(xì)胞被侵害信號(hào)后，誘導(dǎo)天麻內(nèi)皮層細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性措施，使之產(chǎn)生許多水解酶類，產(chǎn)生的酶被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體包裹成小泡向細(xì)胞外運(yùn)輸和釋放，被釋放的水解酶將入侵的菌絲降解為小分子物質(zhì)被天麻吸收[14]，從而為天麻提供源源不斷營養(yǎng)助其生長。菌索入侵天麻的方式可能與Morrison等[36]研究蜜環(huán)菌侵染木材的形式相似，其侵染過程為蜜環(huán)菌首先在木材皮層外形成菌索，菌索分泌一些粘液基質(zhì)覆蓋在菌索的生長點(diǎn)，菌索頂端變硬而附著，附著點(diǎn)的菌索長出菌絲，然后菌絲以機(jī)械力量和分泌化學(xué)物質(zhì)穿透到寄主皮下。在蜜環(huán)菌侵入天麻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究中，徐錦堂等[37]研究表明蜜環(huán)菌菌絲由天麻皮層的菌絲流細(xì)胞經(jīng)紋孔侵人大型細(xì)胞，其通道細(xì)胞被真菌所破壞而形成共生關(guān)系，但消化細(xì)胞通過反寄生而獲取密環(huán)菌的營養(yǎng)[14]。而董兆彬等[38]分別運(yùn)用電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡研究了蜜環(huán)菌侵染天麻后皮層的3種細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，得出天麻同化蜜環(huán)菌的過程需要經(jīng)過若干皮層細(xì)胞和大型細(xì)胞共同完成。天麻細(xì)胞溶酶體是菌絲消化和自溶的重要細(xì)胞器，其中含有大量的酸性磷酸酶[39，40]。為了確定不同染菌細(xì)胞在消化蜜環(huán)菌過程中的作用，王貨等[13]采用酸性磷酸酶的細(xì)胞化學(xué)定位方法進(jìn)行了研究，說明了天麻皮層細(xì)胞不能釋放水解酶消化菌絲，只有消化層細(xì)胞能釋放磷酸酶消化菌絲;因而說明天麻的皮層細(xì)胞中消化細(xì)胞層是天麻消化和吸收蜜環(huán)菌營養(yǎng)的主要場所，與Kusano[41]研究結(jié)果相同;但并沒有證明蜜環(huán)菌侵入天麻表皮層時(shí)天麻是通過何種誘導(dǎo)機(jī)制克服了蜜環(huán)菌的病理性入侵及其生理性變化。

在生理方面，胡忠[42]從天麻頂生球莖中分離出一種抗真菌蛋白（Gastsodia Antifungal Protein.GAFP），在天麻球莖外層組織中含量較多，內(nèi)層薄壁組織沒有，認(rèn)為該蛋白（GAFP）在天麻當(dāng)年頂生和側(cè)生球莖中對(duì)阻止真菌的侵染和防衛(wèi)中起重要作用。楊增明等[43]從天麻的初生球莖分離出幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶，顯示出其對(duì)蜜環(huán)菌的侵染防御性不高。Morrison[36]研究了全球不同地區(qū)23個(gè)蜜環(huán)菌生物種的毒性與菌索形態(tài)的關(guān)系，認(rèn)為其侵染性與蜜環(huán)菌索的生長特性密切相關(guān)，進(jìn)一步說明不同蜜環(huán)菌對(duì)天麻表皮層細(xì)胞侵染性不同。

3蜜環(huán)菌胞外酶對(duì)天麻的影響

近年來，許多研究者也注意到蜜環(huán)菌和天麻的胞外酶對(duì)兩者的生長發(fā)育起著關(guān)鍵作用，王賀[13]用溶酶體酸性磷酸酶的細(xì)胞化學(xué)方法詳細(xì)研究了兩者之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)天麻皮層消化細(xì)胞是釋放水解酶消化真菌的主要場所。鄒寧等[44]采用蜜環(huán)菌（A.mellea）的胞內(nèi)胞外提取物對(duì)天麻進(jìn)行組織培養(yǎng)，得出胞內(nèi)提取液有相應(yīng)的抑制效果，胞外提取液有促進(jìn)效果。曾春函等[45]研究了8種蜜環(huán)菌的胞外漆酶、果膠酶和纖維素酶的生物活性，得出各蜜環(huán)菌首先分泌果膠酶和纖維素酶，然后才是漆酶。劉曉杰等[46]研究了黃綠蜜環(huán)菌的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶活性，結(jié)果表明30℃下酶活穩(wěn)定性最高，pH值在6～7范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定最好。而譚彧文等[47]采用蜜環(huán)菌與天麻實(shí)現(xiàn)共生的區(qū)域，獲取其RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，得出蜜環(huán)菌侵入到天麻內(nèi)皮層后，胞外酶纖維素酶、木聚糖酶、漆酶以及多聚半乳糖醛酸酶基因大部分處于下調(diào)狀態(tài)，與曾春函等[45]的研究結(jié)果相吻合。說明蜜環(huán)菌侵入天麻內(nèi)皮層后其侵染性基因受到相應(yīng)地抑制。

4天麻營養(yǎng)的供給

蘭進(jìn)等[48]運(yùn)用顯微放射自顯影的方法研究了蜜環(huán)菌吸收消化3H-葡萄糖后再侵染天麻的過程，得出蜜環(huán)菌能吸收消化周圍環(huán)境中的3H-葡萄糖，吸收3H-葡萄糖的蜜環(huán)菌再侵染天麻皮層細(xì)胞時(shí)，菌絲被溶解、消化，然后經(jīng)天麻維管運(yùn)輸使3H分布于天麻細(xì)胞的各個(gè)細(xì)胞器中。王貨等[14]認(rèn)為天麻攝取真菌營養(yǎng)的過程是一個(gè)復(fù)雜的消化吸收過程，其為先消化后吸收，且是天麻營養(yǎng)的主要來源。徐錦堂等[1]的研究表明，蜜環(huán)菌索侵入天麻營養(yǎng)莖、繁殖莖后，形成菌絲流，其向內(nèi)直接侵入大型細(xì)胞被天麻消化作為營養(yǎng);而切斷天麻與菌材連接的蜜環(huán)菌索，新生麻就停止生長。說明菌絲通道是天麻整個(gè)生長期營養(yǎng)的補(bǔ)給線。莊毅[49]通過同位素標(biāo)記方法，得出天麻除從蜜環(huán)菌獲得營養(yǎng)外，還可以從土壤中得到補(bǔ)充。吳沿友等[50]研究認(rèn)為天麻礦物質(zhì)吸收途徑：通過蜜環(huán)菌的“泵”作用獲得;天麻自身也可直接從外界環(huán)境獲得部分養(yǎng)分。

5天麻防衛(wèi)系統(tǒng)和“食菌”系統(tǒng)

胡忠[42]從天麻頂生球莖中分離抗真菌蛋白（Gastsodia Antifungal Protein.GAFP），球莖外層組織富含，內(nèi)層薄壁組織沒有。認(rèn)為該蛋白（GAFP）在阻止真菌對(duì)當(dāng)年生頂生和側(cè)生球莖的侵染和防衛(wèi)機(jī)制中起重要作用。之后江流等[51]采用免疫熒光定位法，證實(shí)了GAFP在天麻次生塊莖表皮含量較高，皮層相對(duì)較低。同時(shí)胡忠等[52]也采用免疫熒光法說明了GAFP是密環(huán)菌侵染天麻營養(yǎng)莖后被大量合成，之后輸送至頂生球莖，積累于皮層細(xì)胞，是使頂生球莖處于拒菌狀態(tài)的一種重要蛋白。胡忠等[53]又深入地研究了GAFP-Ⅰ的氨基酸序列和cDNA核苷酸序列，得出GAFP抗菌活性可能與蜜環(huán)菌表面某種糖配基專一結(jié)合而發(fā)揮作用。而徐榮華等[54]運(yùn)用熒光試劑異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate， FITC）標(biāo)記法，證明了GAFP對(duì)木霉菌絲作用位點(diǎn)在細(xì)胞壁上。劉成運(yùn)[55]借助于熒光顯微鏡研究了蜜環(huán)菌侵染天麻過程中的一系列變化，發(fā)現(xiàn)酸性磷酸酶、脂酶主要分布在含蜜環(huán)菌菌絲的天麻皮層細(xì)胞，而脂酶在大型細(xì)胞的叢狀體、崩解核及含菌絲的天麻皮層細(xì)胞活性強(qiáng)烈。ATP酶、多酚氧化酶、過氧化物酶在天麻菌絲皮層細(xì)胞和大型細(xì)胞內(nèi)活性明顯。通過對(duì)天麻營養(yǎng)來源的進(jìn)一步研究，許多研究認(rèn)為皮層細(xì)胞和大型細(xì)胞參與了消化，而天麻皮層的抗真菌蛋白是抵御蜜環(huán)菌入侵的主要物質(zhì)[3，42，56，57]，皮層細(xì)胞、消化細(xì)胞釋放溶菌酶、消化酶、幾丁質(zhì)酶等對(duì)入侵菌絲流發(fā)揮消化起關(guān)鍵作用[3，55]。而實(shí)踐也證明只有健康的菌索能與休眠期和萌發(fā)期的原生球莖實(shí)現(xiàn)共生生長，不能與新生和旺盛期天麻實(shí)現(xiàn)共生。

6問題與展望

綜合以上各方面的研究，天麻與蜜環(huán)菌的選擇機(jī)制還需進(jìn)一步研究，相比其它真菌的侵染植物體系均存在相應(yīng)的誘導(dǎo)機(jī)制、向觸性，當(dāng)蜜環(huán)菌侵入植物體后是如何實(shí)現(xiàn)共生關(guān)系的，實(shí)現(xiàn)共生關(guān)系的機(jī)制如何，目前知之甚少。而在蜜環(huán)菌侵入天麻皮層后，天麻植物體內(nèi)多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL又是怎樣表達(dá)與調(diào)控的，在這過程中又發(fā)揮著何種作用，都還不甚了解。雖然在蜜環(huán)菌基因研究方面有了一些研究，但是均為菌種的鑒定方面，如Tsykun等[58]研究了歐洲6個(gè)蜜環(huán)菌種的3個(gè)DNA核糖體區(qū)域基因（IGS-1，ITS，EF-1a）的表達(dá)性;但是在天麻相應(yīng)基因是如何誘導(dǎo)相應(yīng)的蜜環(huán)菌為其提供營養(yǎng)及其如何防御蜜環(huán)菌進(jìn)一步侵入使其不發(fā)生病理性侵害這方面研究得很少。然而天麻生物種基因的差異性表現(xiàn)出的調(diào)控能力和蜜環(huán)菌生物種基因表現(xiàn)出的侵染強(qiáng)弱應(yīng)該是天麻生物種與蜜環(huán)菌生物種選擇共生性的基礎(chǔ)。同時(shí)，從天麻生長繁衍的角度看，天麻生物種對(duì)相應(yīng)蜜環(huán)菌的誘導(dǎo)性強(qiáng)大，蜜環(huán)菌的入侵性較弱，則天麻生長;相反，如果誘導(dǎo)性較弱，入侵性較強(qiáng)，則天麻被吞噬，因此只有具備強(qiáng)大的誘導(dǎo)系統(tǒng)的天麻種與入侵較弱的蜜環(huán)菌種結(jié)合，才能使天麻通過相應(yīng)的策略獲得營養(yǎng)以維持自身的生長繁衍。為此天麻對(duì)蜜環(huán)菌的選擇共生機(jī)制還需進(jìn)一步研究明確。

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（責(zé)任編輯李媛媛）