焦旭靜 馮 婷 裴曉華 薛辰全 董應(yīng)尚

(1.北京吉天儀器有限公司，北京 100015；2.山東省荷澤生態(tài)環(huán)境檢測中心，荷澤 274000)

1 前言

硫柳汞和苯基汞是一類含汞的有機(jī)化合物，長期以來一直做為防腐劑被廣泛應(yīng)用于眼科制劑和生物疫苗。硫柳汞的代謝或降解產(chǎn)物為乙基汞和水楊酸鈉，其作用機(jī)制為汞離子與菌體中酶蛋白的-SH(巰基)結(jié)合而使酶失去活性[1]從而抑制細(xì)菌生長；苯基汞具有抑制霉菌的作用。汞化合物會(huì)破壞表皮層的酵素活動(dòng),使黑色素?zé)o法形成，具有一定的美白功效，導(dǎo)致一些不法商人將汞類化合物違法添加至化妝品中。雖然硫柳汞和苯基汞具有抑菌、美白的作用，但是它們存在一定的毒性，在使用時(shí)容易通過皮膚等吸收到體內(nèi)，并且在體內(nèi)具有蓄積性，可能會(huì)引起中毒，引發(fā)神經(jīng)性疾病[2]?！禛B 7916-1987化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)化妝品中硫柳汞含量和范圍做了相關(guān)規(guī)定，用量不超過0.007%(汞計(jì))，僅用于眼部化妝品和眼部卸妝品[3]。

目前，針對(duì)化妝品中硫柳汞和苯基汞的檢測方法很多，常見的液相色譜法[4]、原子吸收分光光度法分光光度法[5]、紫外分光光度法[6]、有高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法[7]和毛細(xì)管電泳法[8]等。本實(shí)驗(yàn)參考2019年06月04日發(fā)布的《GB/T 37649-2019 化妝品中硫柳汞和苯基汞的測定 高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法》[9]中樣品預(yù)處理方法，建立了用液相色譜進(jìn)行分離，原子熒光光譜儀進(jìn)行測定的化妝品中硫柳汞和苯基汞的方法，該方法檢出限低，分析速度快，精密度好，儀器性價(jià)比高，適用于化妝品中硫柳汞和苯基汞的檢測。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

SA50-Kylin S18液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀(北京吉天儀器有限公司)；KQ-300DE臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司)；3-18R冷凍離心機(jī)(恒諾儀器)。

硫柳汞標(biāo)準(zhǔn)品(純度96%，Dr.Ehrenstorfer)；苯基汞標(biāo)準(zhǔn)品(純度91%，Dr.Ehrenstorfer)。

鹽酸(優(yōu)級(jí)純)；氫氧化鉀(分析純)；硼氫化鉀(優(yōu)級(jí)純)；甲醇(色譜純)；L-半胱氨酸(優(yōu)級(jí)純)；乙酸銨(優(yōu)級(jí)純)；實(shí)驗(yàn)用水均為實(shí)驗(yàn)室超純水。

2.2 儀器工作條件

液相色譜條件：色譜柱(Agela Venusil MP C18 4.6*150mm，5μm)；保護(hù)柱(Agela C18保護(hù)柱4.6*10mm)；柱溫箱30℃；洗脫方式：梯度洗脫(詳見表1)；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：乙酸銨溶液(60mmol/L乙酸銨+0.1%L-半胱氨酸)；流速為1mL/min；進(jìn)樣量為100μL。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

原子熒光條件：負(fù)高壓：290V；Hg燈燈電流(40mA)；載氣：300mL/min；屏蔽氣：500mL/min；爐高：12mm；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：65r/min；載流：5%HCl；還原劑：1.5%KBH4+0.5%NaOH。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確稱取5mg硫柳汞標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，制得硫柳汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 (500mg/L)；準(zhǔn)確稱取5mg苯基汞標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，制得苯基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(50mg/L)。

標(biāo)準(zhǔn)中間液配制：分別準(zhǔn)確移取0.1mL硫柳汞標(biāo)準(zhǔn)溶液 (50mg/L)和0.25mL苯基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液 (500mg/L)于10mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，制得混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(硫柳汞500μg/L，苯基汞12.5mg/L)；儲(chǔ)存在0～4℃冰箱備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：準(zhǔn)確移取0.050mL、0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.0mL混合中間液(硫柳汞500μg/L，苯基汞12.5mg/L)分別加入到10mL容量瓶中，分別加入3mL甲醇，用乙酸銨溶液定容至刻度，制得一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(硫柳汞濃度分別為2.5μg/L、5.0μg/L、12.5μg/L、25.0μg/L、50.0μg/L ；苯基汞濃度分別為62.5μg/L、125.0μg/L、312.5μg/L、625.0μg/L、1250μg/L )。

2.4 樣品處理

稱取0.2g樣品于15mL刻度離心管中，加入4.5mL甲醇，超聲提取30min后，用乙酸銨溶液定容至15mL，混合均勻，置于8000r/min高速離心機(jī)上離心15min，取上清液經(jīng)0.45μm過濾，濾液進(jìn)行上機(jī)檢測，同時(shí)做樣品空白。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的條件對(duì)汞化合物的分離效果和靈敏度起到了關(guān)鍵性的作用，考察洗脫硫柳汞和苯基汞時(shí)甲醇的比例為10%、20%、30%、40%和50%時(shí)對(duì)分離度和靈敏度的影響，隨著甲醇比例的升高，硫柳汞和苯基汞的分離度逐漸減小，甲醇比例為50%時(shí)分離度為2.3，甲醇比例為30%時(shí)硫柳汞的靈敏度最高，甲醇比例為50%時(shí)苯基汞的靈敏度最高，為了兼顧分離度和靈敏度，最終選擇甲醇比例為50%，可有效的洗脫硫柳汞和苯基汞。

3.2 原子熒光光譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了KBH4濃度為1%、1.5%、2%、3%和4%(m/V)對(duì)硫柳汞和苯基汞熒光強(qiáng)度的影響。如圖1所示，當(dāng)濃度為1.5%時(shí)硫柳汞和苯基汞具有最高的熒光強(qiáng)度，繼續(xù)提高KBH4濃度，硫柳汞和苯基汞的熒光強(qiáng)度反而有不同程度的下降，故本實(shí)驗(yàn)選擇KBH4溶液的濃度為1.5%(m/V)。

3.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

本實(shí)驗(yàn)中化妝品試樣處理選用10mL甲醇溶解樣品，超聲提取后用乙酸銨溶液定容至15mL，本實(shí)驗(yàn)考察了加入4.5mL、7.5mL和10mL甲醇溶解樣品，對(duì)峰型及加標(biāo)回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入7.5mL和10mL甲醇溶解樣品時(shí)，硫柳汞和苯基汞的峰展寬，硫柳汞的峰有毛刺，且加標(biāo)回收率均偏低，加入4.5mL甲醇溶解樣品時(shí)，硫柳汞和苯基汞峰型最好，加標(biāo)回收率高，故本實(shí)驗(yàn)選用4.5mL甲醇溶解樣品，實(shí)驗(yàn)過程中，標(biāo)準(zhǔn)工作液中的甲醇比例也需與試樣中的甲醇比例一致，避免產(chǎn)生溶劑效應(yīng)。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1方法重復(fù)性

配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(硫柳汞25μg/L，苯基汞625μg/L)進(jìn)樣100μL, 連續(xù)進(jìn)樣7針，以保留時(shí)間來衡量定性重復(fù)性，以峰面積來衡量定量重復(fù)性，詳細(xì)結(jié)果見表2，保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為0.30%～0.33%，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為4.22%～4.96%，表明儀器具有良好的重復(fù)性。

表2 硫柳汞和苯基汞的儀器方法重復(fù)性(n=7)

3.4.2方法檢出限、定量限及線性

將硫柳汞和苯基汞系列混合工作液進(jìn)行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的標(biāo)液濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)；以信噪比S/N=3 確定檢出限(limit of detection，LOD)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，硫柳汞在2.5μg/L～50μg/L和苯基汞在62.5μg/L ～1250μg/L的范圍內(nèi)線性相關(guān)性較好，線性相關(guān)系數(shù)(r)大于0.999，硫柳汞檢出限為0.060μg/L，苯基汞檢出限為0.23μg/L，色譜圖見圖2。

表3 硫柳汞和苯基汞的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

圖2 硫柳汞和苯基汞色譜圖

3.4.3方法的回收率

選取化妝水、卸妝油、眼霜、乳液和珍珠霜5種樣品作為實(shí)驗(yàn)樣品，測樣品中硫柳汞和苯基汞的本底值，并分別對(duì)樣品進(jìn)行3個(gè)濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：硫柳汞的加標(biāo)回收率為84.7%～101.7%，苯基汞的加標(biāo)回收率為84.1%～103.9%，該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

3.5 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用本研究所建立的方法，對(duì)市售的5種化妝品(化妝水、卸妝油、眼霜、乳液和珍珠霜)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品中硫柳汞和苯基汞均為未檢出，詳細(xì)結(jié)果見表4。

表4 樣品中硫柳汞和苯基汞的本底值及加標(biāo)回收率

4 結(jié)論

建立了液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用技術(shù)檢測化妝品中硫柳汞和苯基汞的方法，樣品采用甲醇超聲提取的方式，采用甲醇和乙酸銨溶液(0.06mol/L乙酸銨+0.1%L-半胱氨酸)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)C18(4.6*150mm，5μm)柱分離后經(jīng)原子熒光測定，11min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)硫柳汞和苯基汞的分析測試。硫柳汞和苯基汞標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999，硫柳汞的檢出限為0.060μg/L，苯基汞的檢出限為0.23μg/L(S/N=3)，硫柳汞和苯基汞的回收率在84.1%～103.9%之間。實(shí)驗(yàn)所建立的方法與國標(biāo)《GB/T 37649-2019 化妝品中硫柳汞和苯基汞的測定 高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法》對(duì)比，分析時(shí)間短，靈敏度高，檢出限低，可對(duì)化妝品中硫柳汞和苯基汞進(jìn)行更快速準(zhǔn)確的測定，對(duì)化妝品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測具有重要意義。