發(fā)酵型果酒中甲醇和雜醇油的研究進(jìn)展

張 香，秦 丹，曾 璐，陳長(zhǎng)松

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

湖南 長(zhǎng)沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128；4.天下果業(yè)開發(fā)有限公司，湖南 湘西自治州416000）

果酒是以水果為原料經(jīng)發(fā)酵及一系列工藝處理得到的低酒精度飲料酒[1]。由于原料或生產(chǎn)環(huán)節(jié)的影響，果酒釀制過程中不可避免有甲醇、雜醇油產(chǎn)生，它們攝入過量會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成威脅[2]。因此世界各國(guó)都對(duì)此進(jìn)行了限定，歐盟標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，以水果為原料的蒸餾酒的甲醇含量應(yīng)小于4.00 g/L（以酒精度40%vol計(jì)算），美國(guó)對(duì)此的標(biāo)準(zhǔn)是甲醇含量應(yīng)小于2.80 g/L[3]。我國(guó)對(duì)果酒中甲醇含量的限定也非常嚴(yán)格，國(guó)標(biāo)GB 15037—2006《葡萄酒》規(guī)定紅葡萄酒中甲醇含量≤400 mg/L，白、桃紅葡萄酒中甲醇含量≤250 mg/L，但目前我國(guó)對(duì)其他水果釀造的發(fā)酵酒的甲醇含量尚無明確規(guī)定，主要參考葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)。適量的雜醇油雖然可以襯托酯香，增強(qiáng)果酒的風(fēng)味，但過量則不僅導(dǎo)致果酒產(chǎn)生邪雜味，而且對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)有毒害作用，是導(dǎo)致“上頭”的主要因素之一[4]，因此在釀造過程中對(duì)甲醇和雜醇油含量進(jìn)行調(diào)控，對(duì)提升果酒的品質(zhì)和安全性具有重要意義。

1 甲醇及雜醇油對(duì)人體的危害

甲醇是果酒釀造過程中極易生成的副產(chǎn)物，有研究表明，人一旦攝入5 g就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重中毒，超過12.5 g就可能導(dǎo)致死亡[5]。其毒性體現(xiàn)在對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有麻醉作用，且在體內(nèi)不易排出而發(fā)生蓄積。另外在脫氫酶作用下，甲醇可被轉(zhuǎn)化為甲醛、甲酸，對(duì)氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生抑制，使需氧代謝受阻，使乳酸及其他有機(jī)酸發(fā)生堆積，引起機(jī)體代謝性酸中毒；同時(shí)，甲醇對(duì)眼組織毒害較大，甲醇及其代謝物甲醛、甲酸在眼房水和眼組織內(nèi)含量較高時(shí)，可引發(fā)視網(wǎng)膜代謝障礙，造成視網(wǎng)膜細(xì)胞、視神經(jīng)損害及視神經(jīng)脫髓鞘[6]。基于上述原因，在發(fā)酵酒生產(chǎn)中嚴(yán)格控制甲醇含量成為必然。

雜醇油是具有三個(gè)及以上碳原子的一元醇類脂肪醇混合物的俗稱，果酒中的雜醇油主要是丙醇、丁醇、異丁醇、戊醇、異戊醇等。雜醇油是原料中的蛋白質(zhì)水解成氨基酸，再經(jīng)酵母或糖化菌分泌的脫羧酶和脫氨基酶作用而生成，它還能與有機(jī)酸發(fā)生酯化反應(yīng)，生成酯類物質(zhì)使酒體豐滿，故是果酒中重要的呈味物質(zhì)和芳香物質(zhì)。但雜醇油含量過高時(shí)，不但起不到呈香、呈味的作用，反而會(huì)使酒體苦、澀、沖、辣，有令人有不愉快的異雜味，失去原有風(fēng)格[7]。同時(shí)，雜醇油過量攝入對(duì)人體有毒害作用，它能令飲用者神經(jīng)系統(tǒng)充血，且因在人體內(nèi)代謝慢，停留時(shí)間長(zhǎng)，使人感覺頭痛易醉，也就是常說的“上頭”現(xiàn)象[4]。雜醇油類化合物對(duì)人體的毒性經(jīng)研究表明，通常隨分子質(zhì)量的增大而加劇，果酒中以異丁醇和異戊醇的毒性為較大[8]。控制果酒中雜醇油含量是提升果酒品質(zhì)的重要措施之一。

2 發(fā)酵過程中甲醇及雜醇油的生成機(jī)理

2.1 甲醇的生成及影響因素

果酒在釀造過程中易產(chǎn)生甲醇，這與原料果膠含量、果膠酶及酵母菌的作用有較大關(guān)聯(lián)，目前其生成機(jī)理的研究主要集中在果膠分解代謝和甘氨酸代謝兩個(gè)途徑[9]。

果膠分解代謝途徑是指，果膠在果膠酯酶的作用下分解成甲醇和果膠酸（式1），原果膠、果膠酶含量都對(duì)甲醇的生成量有影響[10]。YURI L等[11]研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞壁果膠在果膠酯酶參與下形成甲醇。CABAROGLU T等[12]對(duì)100多種葡萄酒樣進(jìn)行了甲醇含量的分析，試驗(yàn)證明了甲醇含量與破碎時(shí)果膠的進(jìn)入有直接的關(guān)系。白鳳岐[13]通過對(duì)比添加果膠組、脫除果膠組、對(duì)照組酒中甲醇含量的差異，證明果品果膠含量與其釀造酒的甲醇含量成正比。

此外，果膠酶的種類和添加量都對(duì)甲醇的生成有顯著影響。劉文等[14]通過比較兩個(gè)品種桃蒸餾酒中甲醇含量差異性，發(fā)現(xiàn)倉(cāng)方早生和中華壽桃兩品種的桃蒸餾酒甲醇含量差異大，主要是與果實(shí)中的果膠酶含量、果膠含量相關(guān)。姚萬欣[15]對(duì)不同果膠酶添加量的固態(tài)發(fā)酵蒸餾梨酒檢測(cè)其甲醇生成量，發(fā)現(xiàn)甲醇生成量與果膠酶添加量呈顯著正相關(guān)。張卉[16]研究蘋果酒甲醇生成的影響因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，果膠酶處理的果泥、果汁和果渣得到的蘋果酒的甲醇含量分別比對(duì)照組甲醇含量增加了530.06%、668.21%、229.63%（40%乙醇），經(jīng)方差分析顯示均具有有顯著差異，說明果膠酶處理對(duì)蘋果酒的甲醇含量有顯著影響。

甘氨酸代謝被認(rèn)為是甲醇生成的另一主要途徑，其作用機(jī)理是酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精的同時(shí)，果品中的甘氨酸可在脫氨脫羧酶的作用下直接反應(yīng)生成甲醇（式2），或是通過甘氨酸裂解酶先分解生成甲胺（式3），再與亞硝酸反應(yīng)生成甲醇（式4）[15，17]。甘氨酸的濃度與甲醇生成量有密切關(guān)系。武曉娜等[17]通過研究釀酒酵母與甘氨酸發(fā)酵生成甲醇關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甘氨酸質(zhì)量濃度＜0.9 g/L時(shí)，與釀酒酵母生成甲醇的量呈線性關(guān)系，甘氨酸越多時(shí)，產(chǎn)生的甲醇的含量也越多，甘氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了24.2%，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，甲醇的產(chǎn)量不僅與甘氨酸相關(guān)，而且還與酵母的菌種、發(fā)酵工藝的條件相關(guān)。

此外，酵母生長(zhǎng)代謝情況也間接影響甲醇的生成。姚萬欣[15]在固態(tài)發(fā)酵蒸餾梨酒的研究中發(fā)現(xiàn)，隨發(fā)酵溫度的升高和發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，甲醇含量增加。顏雪輝等[18]實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵的溫度升高，酵母菌生長(zhǎng)旺盛，甲醇含量也較高。這也預(yù)示著可能存在與酵母相關(guān)的甲醇生成新途徑，需要深入研究。

2.2 雜醇油的生成及影響因素

雜醇油是原料中蛋白質(zhì)、氨基酸和糖類分解形成的高級(jí)醇類[19]。目前推斷雜醇油的生成途徑有兩種：一是氨基酸降解代謝路徑（Ehrlich代謝機(jī)制）[20-21]，即釀酒原料中的氨基酸先通過轉(zhuǎn)氨酶的促進(jìn)下形成α-酮酸，α-酮酸與脫羧酶進(jìn)一步反應(yīng)形成醛，還原生成較氨基酸少一個(gè)碳原子的雜醇油。另一種是糖合成代謝路徑（Harris代謝機(jī)制）[22]，酵母以糖為基質(zhì)，代謝合成自身必需的氨基酸，其中間體α-酮酸在酶的作用下進(jìn)行脫羧，后通過還原反應(yīng)生成相應(yīng)雜醇油。推斷的代謝途徑見圖1。

圖1 雜醇油的代謝途徑Fig. 1 Metabolic pathway of fusel oil

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)果酒中雜醇油生成的控制主要從可同化氮素和發(fā)酵工藝條件兩個(gè)方面進(jìn)行調(diào)控。可同化氮素是指在酒精發(fā)酵中酵母優(yōu)先利用的氮素，包括游離α-氨基酸、小分子多肽以及銨態(tài)氮等[24]?？赏嘏c雜醇油的形成有密切關(guān)系，在發(fā)酵液中添加可同化氮素會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)物中雜醇油的含量[25]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，添加亮氨酸或異亮氨酸的酵母發(fā)酵混合物導(dǎo)致雜醇油的產(chǎn)量增加[26]。TORREA D等[26]通過比較葡萄發(fā)酵醪液中添加無機(jī)氮和有機(jī)氮對(duì)葡萄酒的揮發(fā)性成分和香氣特性，發(fā)現(xiàn)銨態(tài)氮和有機(jī)氮的添加降低了雜醇油的含量。VIDAL E等[27]研究可同化氮源對(duì)甘蔗酒中雜醇油的影響，發(fā)現(xiàn)向可同化氮素含量低的甘蔗汁中添加銨態(tài)氮后發(fā)現(xiàn)雜醇油的含量降低。商玉薈[28]通過探究不同種類和濃度的外加氮源對(duì)無核荔枝酒品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)外加氮源的種類對(duì)無核荔枝酒中雜醇油的產(chǎn)生有不同影響。

此外，由于酵母種類和發(fā)酵工藝條件能間接調(diào)控酵母的雜醇油代謝，因此酵母種類和發(fā)酵工藝條件與雜醇油的形成也有密切關(guān)系。STAVER M等[29]研究了釀酒酵母菌種對(duì)雜醇油生成的影響，結(jié)果表明選擇適宜的酵母菌種可以明顯降低雜醇油的生成量。發(fā)酵工藝條件也會(huì)影響雜醇油生成。于濤等[30]通過蘋果酒中雜醇油生成控制研究，發(fā)現(xiàn)酵母接種量增大、磷酸氫二銨添加都會(huì)降低蘋果酒中雜醇油的含量，發(fā)酵醪液糖度增大、pH升高、溫度升高都會(huì)增大雜醇油的含量。

3 甲醇及雜醇油檢測(cè)方法的研究

3.1 甲醇檢測(cè)方法的研究

3.1.1 亞硫酸品紅比色法

亞硫酸品紅比色法是國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》規(guī)定為酒精通用試驗(yàn)方法之一，該方法通過高錳酸鉀磷酸溶液將甲醇氧化為甲醛，過量的高錳酸鉀被草酸還原，所生成的甲醛與亞硫酸品紅反應(yīng)，生成醌式結(jié)構(gòu)的藍(lán)紫色化合物，于波長(zhǎng)595 nm處比色測(cè)定。牛桂芬[31]通過幾種白酒中甲醇含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過對(duì)顯色劑品紅-亞硫酸試劑的改進(jìn)，使得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系得到很大提高，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算甲醇濃度，所得中、高標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為2.07%和1.34%，均小于5%，表明精密度良好。

亞硫酸品紅比色法具有所需儀器和試劑簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但在測(cè)定過程中，常遇到顯色不穩(wěn)定，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、工作曲線重現(xiàn)性差和回收率試驗(yàn)不理想等問題。

3.1.2 變色酸比色法

變色酸比色法是國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006規(guī)定為酒精通用試驗(yàn)方法之一，該方法對(duì)甲醇進(jìn)行測(cè)定，通過高錳酸鉀將甲醇氧化成甲醛，過量的高錳酸鉀用偏重亞硫酸鈉除去，甲醛與變色酸在濃硫酸存在下，先縮合，隨之氧化，生成對(duì)醌結(jié)構(gòu)的藍(lán)紫色化合物，在波長(zhǎng)570 nm處比色測(cè)定。孫煥冬等[32]通過優(yōu)化變色酸比色法測(cè)定葡萄酒中甲醇含量的實(shí)驗(yàn)條件，得出穩(wěn)定性良好，準(zhǔn)確度高的實(shí)驗(yàn)方法，該方法呈較好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=15.586X-0.030 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 2。

變色酸比色法其測(cè)定具有操作簡(jiǎn)單、成本低的優(yōu)點(diǎn)，但因其測(cè)定過程同時(shí)受乙醇純度、顯色劑、顯色酸度與時(shí)間、溫度等多種因素影響，存在重現(xiàn)性較差的缺點(diǎn)，目前應(yīng)用較少。

3.1.3 氣相色譜法

氣相色譜法是世界上公認(rèn)的測(cè)定酒中甲醇及雜醇油的方法，其原理是利用不同醇類在氫火焰離子化檢測(cè)器把各組分的濃度信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)后由記錄儀或工作站軟件記錄下來，根據(jù)色譜峰保留時(shí)間可以定性分析，峰面積或峰高可以進(jìn)行定量分析[33]。羅玥[34]研究酒中甲醇測(cè)定方法，分別對(duì)氣相色譜直接進(jìn)樣法和頂空進(jìn)樣法測(cè)定12種酒中的甲醇含量進(jìn)行研究和比較，檢驗(yàn)結(jié)果表明直接進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)法的檢出限為7.5 mg/L，加標(biāo)回收范圍為95%～105%，分析精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）＜2%，該方法具有結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)。盧鷺濱等[35]通過低甲醇金桔蒸餾酒工藝的探究，發(fā)現(xiàn)利用氣相色譜法測(cè)定的金桔蒸餾酒原酒中甲醇含量，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

氣相色譜法可直接分析果酒中甲醇含量，具有精密度高、分離效果好、選擇性高、短時(shí)間內(nèi)能進(jìn)行多次檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但氣相色譜法所需儀器昂貴，檢驗(yàn)程序復(fù)雜、工作量大且測(cè)量過程繁瑣費(fèi)時(shí)[41]。

3.1.4 其他測(cè)定方法

研究酒中甲醇的測(cè)定，除了以上幾種方法外，還有紅外光譜法、高效液相色譜法、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）法、折射法[11，36]。劉建學(xué)等[37]采用近紅外光譜法快速檢測(cè)基酒中的甲醇含量，建立甲醇的定量分析模型，并對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，研究結(jié)果表明，所建立的甲醇定量分析模型與常用的氣相色譜法預(yù)測(cè)效果一致，模型的精密度和穩(wěn)定性良好，可為基酒中甲醇含量的在線快速檢測(cè)提供方法指導(dǎo)。ZHANG Y L等[38]采用傅里葉變換紅外光譜和二維紅外相關(guān)光譜對(duì)不同紅葡萄酒的主要成分和不同干紅葡萄酒的揮發(fā)殘?jiān)M(jìn)行分析。結(jié)果表明，紅外光譜法是一種直接有效的分析不同紅葡萄酒主成分和鑒別不同紅葡萄酒的方法。由于儀器價(jià)格昂貴、靈敏度不高、操作繁瑣、成本高等，這些方法實(shí)際價(jià)值不大。

3.2 雜醇油檢測(cè)方法的研究

3.2.1 比色法

雜醇油的測(cè)定基于脫水劑濃硫酸存在下生成烯類與芳香醛縮合成有色物質(zhì)，以比色法測(cè)定。張建才等[39]通過研究比色法測(cè)定葡萄酒中雜醇油含量的實(shí)驗(yàn)條件，該方法呈較好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=15.586X-0.030 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 2，穩(wěn)定性良好、準(zhǔn)確度高。

比色法具有操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些缺陷，如酒中還有很多物質(zhì)會(huì)干擾顯色，顯色不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較差，靈敏度低，測(cè)定誤差大，線性關(guān)系不理想等，且此法只能檢測(cè)酒中雜醇油的總量，不能區(qū)分出單個(gè)的量。

3.2.2 氣相色譜法

原理同甲醇?xì)庀嗌V分析。遲超逸等[40]通過毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定不同陳釀容器貯存紅棗白蘭地中甲醇、雜醇油含量，建立了一種利用毛細(xì)管氣相色譜法同時(shí)測(cè)定紅棗白蘭地中的甲醇、雜醇油的測(cè)定方法，該方法快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單。結(jié)果表明，方法的RSD≤0.34%，樣品的加標(biāo)回收范圍為97.56%～102.48%，該法具有較高準(zhǔn)確度和精密度。孟雄飛等[41]通過氣相色譜法同時(shí)測(cè)定酒中的甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇等10種成分，結(jié)果顯示酒樣中甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇等10種物質(zhì)的檢出限達(dá)3 mg/L，相關(guān)系數(shù)均在0.999 0以上，該方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD在2.2%～9.9%之間，加標(biāo)回收率范圍為82.3%～118.6%，該法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，所得結(jié)果可靠。

目前氣相色譜法對(duì)酒中的雜醇油進(jìn)行測(cè)定相對(duì)繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，且蒸餾過程中沸點(diǎn)低的雜醇油容易揮發(fā)損失。

3.2.3 光譜分析法

光譜分析法是將近紅外光譜技術(shù)與區(qū)間偏最小二乘法結(jié)合，篩選最優(yōu)近紅外波長(zhǎng)區(qū)間，建立雜醇油含量的預(yù)測(cè)模型。吳同等[42]利用該方法篩選出定量酒中雜醇油含量的最優(yōu)波長(zhǎng)區(qū)間，獲得了預(yù)測(cè)能力優(yōu)于全譜偏最小二乘的校正模型，并在獨(dú)立的測(cè)試集上進(jìn)行了系統(tǒng)驗(yàn)證。該方法具有快速預(yù)測(cè)、預(yù)測(cè)性高、簡(jiǎn)便快捷低成本無污染以及不破壞樣品等優(yōu)點(diǎn)。但因模型構(gòu)建，樣品需要量大，且對(duì)樣品狀態(tài)、測(cè)試方式、測(cè)試條件都有較嚴(yán)格要求，獲取不易，同時(shí)還存在分析軟件操作復(fù)雜等原因，極大的限制了該方法的應(yīng)用。

4 結(jié)論與展望

甲醇和雜醇油是果酒釀造的常見副產(chǎn)物，而飲用甲醇及雜醇油含量過高的果酒可對(duì)人體造成毒害，是評(píng)價(jià)果酒品質(zhì)的重要考量因素，因此，對(duì)其生成量進(jìn)行調(diào)控是果酒研究不可忽略的部分，對(duì)果酒規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)有重要意義。本文對(duì)果酒中甲醇與雜醇油的生成機(jī)理、調(diào)控因素及檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述。目前果酒中甲醇、雜醇油的形成機(jī)理及相互關(guān)系在具體的果酒原料、發(fā)酵條件下，甲醇、雜醇油變化規(guī)律的研究還需進(jìn)一步深入。且當(dāng)前果酒的相關(guān)研究仍多以葡萄酒為主，因此在進(jìn)行特定原料的果酒釀造過程中，還需從原料組分、發(fā)酵工藝入手選擇適宜的試驗(yàn)和檢測(cè)方法。現(xiàn)在甲醇及雜醇油的檢測(cè)多為分別檢測(cè)且方法單一、操作繁瑣，因此在不同原料果酒中同步檢測(cè)甲醇及雜醇油的方法尚待摸索和確立。