廖玲妮

摘? 要：20世紀(jì)90年代，微流控技術(shù)被成功地運(yùn)用在毛細(xì)管技術(shù)中，自此開啟了其商業(yè)化的進(jìn)程。然而，微流控技術(shù)與中醫(yī)藥行業(yè)結(jié)合并將其運(yùn)用到中藥樣本快速檢測中尚屬首次。該文中介紹的新型微流控系統(tǒng)，基于CMOS-MEMS智能微流控技術(shù)，結(jié)合高通量芯片點(diǎn)陣技術(shù)研制系統(tǒng)，整體架構(gòu)包括微泵微閥、多靶標(biāo)檢測體系及卡匣及配套光學(xué)模組，適用于中藥材有效成分、外源性毒性物質(zhì)的快速與量化分析，可以幫助飲片企業(yè)或中藥材種植基地等快速評價(jià)藥材質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：智能微流控;中醫(yī)藥快速檢測;蛋白芯片;微泵;微閥

中圖分類號：R283文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

1 中藥檢測現(xiàn)狀與需求分析

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，幾千年來為中華民族的繁衍生息做出了重大貢獻(xiàn)。在2000～2020年的20年間，無論從產(chǎn)業(yè)規(guī)模還是產(chǎn)業(yè)水平來說，中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)都得到了較大提升。隨著《中醫(yī)藥法》《中藥藥典》等法規(guī)的頒布，中藥標(biāo)準(zhǔn)化、質(zhì)量控制體系、有效性和安全性評價(jià)等問題引起越來越多的關(guān)注。

與西藥不同，中藥材源于自然，本身具有不穩(wěn)定性。但中藥材作為飲片和中成藥的重要原材料，直接關(guān)系到臨床用藥的安全有效及中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。近10年來，政府提倡使用中藥道地藥材，鼓勵(lì)藥材基地化并規(guī)定其質(zhì)量控制應(yīng)該貫穿藥材的炮制、提取到生產(chǎn)的全過程。然而，一方面中藥材基地化種植大幅提高了成本，但對于定價(jià)卻沒有相應(yīng)的優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)政策，導(dǎo)致基地化種植和非基地化種植的藥材價(jià)格并沒有差異對待，因此很多企業(yè)雖然有中藥材種植基地認(rèn)證，實(shí)際上還是繼續(xù)采購基地周邊的藥材，這種分散的、自發(fā)的種植方式在質(zhì)量控制上相對薄弱，農(nóng)藥濫用、重金屬超標(biāo)、摻雜摻假、增色增重和保存不善等情況時(shí)有發(fā)生。另一方面，即使是GPA認(rèn)證的中藥材基地種植的中藥材，能否種植出符合“道地藥材”要求的中藥材，除了種植環(huán)境外，還受生產(chǎn)周期、培植情況和氣候變化等因素的影響。

目前適應(yīng)中藥材的質(zhì)量控制手段相對單一，十分依賴儀器設(shè)備或者由有經(jīng)驗(yàn)的老藥工進(jìn)行檢驗(yàn)，而現(xiàn)實(shí)情況卻是傳統(tǒng)的中藥材性狀鑒別人才流失，必要的儀器設(shè)備缺乏，檢測藥材的場所受限嚴(yán)重。因此，建立一種不依賴大型設(shè)備與實(shí)驗(yàn)室的條件的、靈活便攜的、相對快速的檢測方式，是中藥材質(zhì)量源頭控制急需解決的重要問題。

該文基于中藥材質(zhì)量源頭控制的需求，建立一種適應(yīng)于中藥復(fù)雜成分的、多靶標(biāo)的、微量化的、低成本的和相對快速的快檢系統(tǒng)，適用于“藥物流通前”判斷企業(yè)內(nèi)部質(zhì)量的控制手段，幫助中藥材飲片制造及中成藥生產(chǎn)廠家降低原材料成本和風(fēng)險(xiǎn)，提高原料質(zhì)量，保持飲片或中成藥質(zhì)量一致性，最終提高臨床用藥的安全性和有效性。

2 微流控系統(tǒng)的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)

微流控系統(tǒng)具有超微量、高通量和高度集成的特點(diǎn)[1]。該文設(shè)計(jì)研制的中藥樣本微流控快速檢測系統(tǒng)包括CMOS-MEMS智能微流控微型泵/微閥系統(tǒng)、多靶標(biāo)快速檢測卡匣、定量分析熒光光學(xué)模塊及數(shù)據(jù)處理。其中，微泵系統(tǒng)由CMOS-MEMS微泵芯片及其控制器組成。微閥的作用則是通過PDMS軟性材料鍵合到PMMA、PC等塑料卡夾表面，并配合步進(jìn)電機(jī)控制器實(shí)現(xiàn)的。多靶標(biāo)快速檢測卡匣由塑料流道、多靶標(biāo)檢測體系組成。熒光光學(xué)模塊具有綠色/紅色2色熒光，同時(shí)軟件具有點(diǎn)陣分析及數(shù)據(jù)處理能力。上述模塊組合到一起，就形成了中藥樣本快速檢測系統(tǒng)。

系統(tǒng)檢測原理如下：將中藥樣本與抗體混勻，然后一次加入樣本/抗體混合液、熒光示蹤物、清洗液，通過微泵/微閥控制，使3種液體按一定時(shí)序依次通過檢測區(qū)（如圖1所示）。由于檢測區(qū)域預(yù)先包被了待分析物的結(jié)構(gòu)類似物，當(dāng)樣品、特異性抗體流經(jīng)該區(qū)域時(shí)會(huì)產(chǎn)生競爭性結(jié)合，部分抗體與檢測區(qū)底部結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合并產(chǎn)生相應(yīng)信號，且該信號與樣品中的待分析物濃度呈負(fù)相關(guān)性。通過這種競爭性反應(yīng)可以對樣品中待分析物濃度進(jìn)行量化分析（如圖2所示）。

2.1 微泵與微閥元器件

該文中所指微泵是基于正晶圓工藝研制的CMOS-MEMS微泵，其基本原理是基于熱發(fā)泡技術(shù)開發(fā)的微型泵，由外部控制器控制其工作電壓、發(fā)泡頻率和泵液方向等參數(shù)，使微泵實(shí)現(xiàn)在一定時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定流動(dòng)，其泵速根據(jù)不同流道設(shè)計(jì)可以達(dá)到15 uL/min～30 uL/min，其最大泵液量可以達(dá)到400 uL左右，最大泵液時(shí)間可以達(dá)到0.5 h以上。目前，微泵經(jīng)軟板封裝和膠水黏合等工藝方式，固定在快速檢測卡匣的底部，為整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)行提供基本動(dòng)力。

另一方面，基于PDMS等軟性材料與常規(guī)塑料如PS、PC和PMMA的低溫鍵合技術(shù)，首先通過氧等離子體處理活化PDMS/PMMA材料表面，使其產(chǎn)生羥基（-OH），并將PDMS/PMMA同時(shí)浸泡在5%ATPES硅烷化試劑中，反應(yīng)30 min后，經(jīng)80℃低溫加熱處理3 h，使PDMS/PMMA表面產(chǎn)生化學(xué)交聯(lián)，達(dá)到鍵合目的。當(dāng)軟性材料貼到流道上方并配合常規(guī)步進(jìn)電機(jī)控制時(shí)，可以按照一定的時(shí)序擠壓軟性材料，“開啟”或“關(guān)閉”流道的功能，配合微泵動(dòng)力源，實(shí)現(xiàn)液體流動(dòng)過程中的自動(dòng)切換功能。

2.2 多靶標(biāo)中高通量方案

要實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)測試，首先要對檢測項(xiàng)目進(jìn)行圖案化分區(qū)設(shè)計(jì)，包括對反應(yīng)承載底板進(jìn)行修飾活化、對檢測反應(yīng)物的精細(xì)高通量的固化和對不同檢測靶標(biāo)分區(qū)檢測。

對于反應(yīng)體系的底板材質(zhì)選擇，一般以玻璃基為主，配合化學(xué)偶聯(lián)，對目標(biāo)進(jìn)行固定化。另外有一些以聚合物為底板（如PMMA等），往往以物理吸附方式進(jìn)行目標(biāo)物固化。在測試了石英玻璃、塑料以及硅基后，發(fā)現(xiàn)在相同的曝光時(shí)間條件下，硅基和石英玻璃能夠產(chǎn)生大致相當(dāng)?shù)男盘枏?qiáng)度且背景幾乎檢測不到。在塑料基上則顯示出很高的背景信號，其陽性組別與陰性組別的信號值無顯著差異。

考慮到硅基脆性以及加工工藝往往是納米級的，但中藥快速檢測系統(tǒng)反應(yīng)體系一般都是微升級的，其流道常常是微米級的，所以選擇了在塑料基流道上粘貼硅基檢測區(qū)作為快速檢測方案。

該文設(shè)計(jì)的硅基尺寸為5.4 mm×5.4 mm，其中設(shè)計(jì)點(diǎn)陣為12×8個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)的直徑為150 μm，點(diǎn)中心與點(diǎn)中心的間隔為300 μm。對不同靶標(biāo)固化位置進(jìn)行了分區(qū)。一組核酸質(zhì)控探針，用于校準(zhǔn)不同卡匣或者不同批次存在的表面固化效率差異。一組內(nèi)參質(zhì)控，用于校準(zhǔn)不同測試間反應(yīng)效率的差異性。一組梯度濃度的牛血清白蛋白，用于建立片內(nèi)校準(zhǔn)曲線，用于量化分析總黃曲霉素、總?cè)藚⒃碥?、重金?項(xiàng)共7個(gè)標(biāo)志物。每個(gè)點(diǎn)設(shè)置4～5個(gè)重復(fù)點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)去除一個(gè)顯著離群值，剩余重復(fù)點(diǎn)取平均數(shù)（如圖1所示）。為了達(dá)到設(shè)計(jì)精度需求，選擇了噴墨打印蛋白的方式，單次打印微液滴在氨基化襯底面上形成的直徑在20 μm～30 μm，重復(fù)打印200次，形成150? μm直徑的斑點(diǎn)。

2.3 光學(xué)模組

該文中提及的系統(tǒng)結(jié)合了微流體控制及陣列式分析，常規(guī)的芯片掃描儀由于其僅適配玻璃基芯片，無法兼容為微流控的卡匣設(shè)計(jì)。同時(shí)，由于開放式光學(xué)平臺(tái)如顯微鏡沒有配備相應(yīng)的軟件來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，因此在項(xiàng)目研制過程中客制化了一臺(tái)光學(xué)便攜式設(shè)備（如圖2所示），具有類似掃描儀的數(shù)據(jù)分析能力，可以自動(dòng)捕獲點(diǎn)并批量獲得點(diǎn)像素中位數(shù)等關(guān)鍵信息。

3 開發(fā)技術(shù)難點(diǎn)解析

3.1 蛋白表面固化

該文設(shè)計(jì)的多靶標(biāo)高通量方案參考了生物芯片的設(shè)計(jì)思路，與以往的生物芯片不同，該系統(tǒng)選用了硅基替代傳統(tǒng)的玻璃基材。首先，在硅基上制作一層氧化層，然后通過等離子體增強(qiáng)化學(xué)的氣相沉積法（PECVD）技術(shù)在表面進(jìn)行NH2單分子層沉積，通過醛類活化處理，使硅基表面的氨基基團(tuán)與蛋白表面的氨基基團(tuán)產(chǎn)生化學(xué)交聯(lián)，達(dá)到在硅基表面固化蛋白的效果。

關(guān)于表面固化工藝的關(guān)鍵技術(shù)，項(xiàng)目開發(fā)過程中比較過硅基氧化方式、氧化厚度、氨基修飾方式和醛類活化劑活化條件等。

在硅基氧化工藝中發(fā)現(xiàn)，干氧化工藝與濕氧化工藝相比有顯著信號顯著增高、信號均一性更好的特點(diǎn)，氧化層從100 nm逐步上升到300 nm，其對應(yīng)的免疫熒光信號值也逐步上升。推測原因，氨基修飾的效果應(yīng)該與氧基團(tuán)數(shù)量、密度正相關(guān)。

使用浸泡法、氣相沉積法和等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積法3種手段，對NH2沉積效果進(jìn)行比對。通過接觸角、免疫信號和均一性判斷，發(fā)現(xiàn)等離子增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積（PECVD）沉積NH2功能團(tuán)數(shù)量與其他方法幾乎一致，但均一性效果更好，片間差異小于5%。

3.2 多標(biāo)靶同時(shí)定量

使用噴墨打印技術(shù)對需要固化的區(qū)域首先進(jìn)行活化。對于不同的目標(biāo)物，在實(shí)際測試中發(fā)現(xiàn)其固化偶聯(lián)效率與溶液配方密切相關(guān)，不同添加劑對目標(biāo)物的表面張力、黏度、點(diǎn)樣一致性和偶聯(lián)效率上都會(huì)產(chǎn)生影響，最終確認(rèn)了最適張力、黏度等參數(shù)。通過對表面活性劑、pH、增稠劑和保濕劑等多種組分的分析實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)加入0.01%Tween20，pH 7.0，5%甘油可以有效改善點(diǎn)樣時(shí)產(chǎn)生的拖尾、咖啡環(huán)和結(jié)合效率偏低等問題。

同時(shí)，為達(dá)到多靶標(biāo)同時(shí)定量的效果，該系統(tǒng)設(shè)有2組內(nèi)參。1）內(nèi)參質(zhì)控1是通過合成獲得的DNA—NH2熒光探針，通過DNA—NH2與硅基-NH2交聯(lián)作用，固化到硅基上，由于DNA—NH2不參與免疫反應(yīng)，因此內(nèi)參質(zhì)控1用于校準(zhǔn)不同卡匣在工藝過程中產(chǎn)生的差異。2） 內(nèi)參質(zhì)控2偶聯(lián)了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度的惰性蛋白，在反應(yīng)中加入濃度確定不變的示蹤物。由于該內(nèi)參信號由免疫反應(yīng)產(chǎn)生，所以可以用于反應(yīng)過程中的校準(zhǔn)，如溫度、流速或者樣本雜質(zhì)引起的干擾、不同稀釋倍數(shù)引起的基質(zhì)效應(yīng)等。參考ELISA經(jīng)典方法，在同一反應(yīng)片上校準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)片內(nèi)定量。通過質(zhì)控1校準(zhǔn)整體熒光信號，質(zhì)控2校準(zhǔn)獲得校準(zhǔn)曲線及靶標(biāo)的相對熒光信號，然后通過校準(zhǔn)曲線對靶標(biāo)進(jìn)行量化分析。與沒有進(jìn)行三重質(zhì)控的分析方式相比，各靶標(biāo)的相對偏差RD從57%下降至11%，IC50處的變異系數(shù)CV<10%，基本滿足樣本快速篩選的需求。

4 結(jié)語

該項(xiàng)目開發(fā)的快速檢測系統(tǒng)適用于中藥樣本快速篩選，判斷藥材是否符合企業(yè)采購標(biāo)準(zhǔn)。在前期研發(fā)中基于中藥藥典的前處理方式，將樣本中的待測物如人參皂苷、黃曲霉素、重金屬從藥材中分離萃取出來，不依賴于HPLC、質(zhì)譜等大設(shè)備，檢測時(shí)間也縮短至30 min，適合小型監(jiān)測站乃至田間地頭使用。該套快速檢測系統(tǒng)同樣可以用于其他領(lǐng)域，例如食品安全評價(jià)、水質(zhì)評價(jià)和臨床POCT檢測等領(lǐng)域，屬于行業(yè)共性技術(shù)和平臺(tái)。

目前該項(xiàng)目集成了7種不同的靶標(biāo)測試，其技術(shù)平臺(tái)的本質(zhì)是生物芯片技術(shù)，可以集成成百上千的靶標(biāo)到同一個(gè)卡匣中進(jìn)行測試，實(shí)現(xiàn)一次樣本處理，從而快速獲得全面、高通量的檢測結(jié)構(gòu)，特別符合食品安全和中藥行業(yè)質(zhì)量控制的需求。

參考文獻(xiàn)

[1]陳超瑜，馬妍，方群.微流控器官芯片的研究進(jìn)展[J].分析化學(xué)，2019，47（11）：1711-1720.