王旭

（遼東學(xué)院海岸帶生物技術(shù)研究所，遼寧 丹東 118003）

水霉病是世界性淡水養(yǎng)殖魚類的病害，各種淡水成魚、魚苗和魚卵都可發(fā)生，傳染性強(qiáng)，發(fā)病率及死亡率高[1]。該病的病原為卵菌綱，水霉屬真菌[2]。寄生水霉Saprolegnia parasitica 是目前已發(fā)現(xiàn)的最重要的病原菌，其孢子萌發(fā)快，侵襲能力強(qiáng)，幾乎能夠感染包括鯽Carassius auratus 斑馬魚Barchydanio rerio、鱘Acipenser 及鱸Lateolabrax japonicus 等在內(nèi)的所有淡水魚類及其卵[3-6]?？兹甘G曾是治療水霉病最有效的化學(xué)試劑，但其強(qiáng)致畸、致癌及高殘留，已被禁用。目前防治水霉病主要采用抗生素、殺菌劑、中草藥、氧化劑等[7-13]。這些方法易造成水霉的耐藥性、效果不明顯、成本高、有效濃度超出安全限量等問題，使用受限[14]。研究發(fā)現(xiàn)，有些微生物來源的活性成分可以抑制真菌的生長和感染，且具有綠色、環(huán)保、安全、高效的優(yōu)點(diǎn)[15]。其中，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、地衣芽孢桿菌Baclicus lincheniformis 等具有非致病、耐儲(chǔ)存、使用方便等特點(diǎn)，是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用最為廣泛的益生菌[16，17]。本試驗(yàn)以寄生水霉為靶標(biāo)菌，通過平板對(duì)峙培養(yǎng)，篩選出抑制水霉生長的芽孢桿菌，并研究其抑菌穩(wěn)定性，以期為水霉病的生物防治提供優(yōu)良菌種資源和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

靶標(biāo)菌株SMJ-1 及其他寄生水霉菌株SMJ-2、SMJ-3、SMJ-4 分別分離自遼寧省東港市淡水養(yǎng)殖池塘的散鱗鏡鯉Cyprinus carpio var.specularis 發(fā)病組織和卵，彭澤鯽Carassius auratus var.pengze、大鱗副泥鰍Paramisgurnus dabryanus 的發(fā)病組織。經(jīng)純化、致病性測(cè)定和分子鑒定，確定其均為寄生水霉。待篩選菌株為分離保藏的27 株細(xì)菌菌株，保存于遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院微生物工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂20.0g、水1000mL，pH7.2～7.6。水霉培養(yǎng)和平板對(duì)峙試驗(yàn)采用PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0g、葡萄糖20.0g、瓊脂20.0g、水1000mL，自然pH。

1.1.3 拮抗菌基因組DNA 提取及16S rRNA 序列擴(kuò)增試劑

Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、Premix Taq Version 2.0 （Loading dye mix）、DNA Marker（DL-2000）購自寶生物工程（大連）有限公司，引物27F/1492R（27F：5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’；1492R：5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌篩選

初篩：采用平板對(duì)峙法。將活化后的寄生水霉用直徑0.6cm 的無菌打孔器制備菌餅，接種于PDA平板中央，18℃培養(yǎng)24h 后，采用十字交叉法，在距離靶標(biāo)菌餅2cm 處對(duì)稱點(diǎn)接待篩選菌株，以不接菌一側(cè)為對(duì)照。置于18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至對(duì)照一側(cè)長滿平板后測(cè)量抑菌帶寬度，確定待篩菌株的抑菌效果。

復(fù)篩：采用發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)。初篩所得拮抗菌株接種于裝量40%的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30℃發(fā)酵48h。發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌濾器過濾后，按照1∶5 的比例與55℃的PDA 培養(yǎng)基混合均勻，制備平板。冷卻后，在平板中央接種寄生水霉菌餅，以無菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)，于18℃培養(yǎng)至對(duì)照長滿平板后，測(cè)量各處理的菌落直徑，計(jì)算抑菌率。抑菌率（%）=（對(duì)照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑/對(duì)照菌落生長直徑）×100。

1.2.2 拮抗菌鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

將純化的拮抗菌劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)、顏色等性狀。挑取少量菌體制備抹片，經(jīng)革蘭氏染色后，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]，在顯微鏡下觀察染色特征、菌體形態(tài)及特殊結(jié)構(gòu)。

1.2.2.2 拮抗菌16S rRNA 序列分析

拮抗菌基因組DNA 提取按照Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR 步驟要求進(jìn)行。16S rRNA 序列擴(kuò)增采用通用引物27F/1492R，擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序參照李娟等[19]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，所測(cè)序列在Genbank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 對(duì)比分析。運(yùn)用Clustal X（Version 1.83）和Mega 6.06 軟件[19]進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 拮抗菌傳代穩(wěn)定性測(cè)定

將拮抗菌菌液以5%的接種量接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，每48h 轉(zhuǎn)接1 次，連續(xù)傳代10 次，每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)。發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)測(cè)定出發(fā)菌株與傳代菌株對(duì)寄生水霉的抑菌效果，根據(jù)抑菌率變化分析傳代對(duì)拮抗菌抑菌效果的影響。

1.2.4 拮抗菌發(fā)酵液熱穩(wěn)定性測(cè)定

用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基發(fā)酵拮抗菌，將5%的試驗(yàn)菌株菌液接種于裝量為40%的500mL 三角瓶中，30℃，120 r/min，培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液采用無菌濾膜過濾，濾液4℃冷藏備用。

取各發(fā)酵濾液15mL 分別加入到20mL 直口離心管中，置于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃下處理2h。之后，按照1∶5 的比例，將處理后的發(fā)酵濾液分別與滅菌后冷卻至55℃的PDA 培養(yǎng)基混合均勻制備平板。每個(gè)平板中央接種寄生水霉菌餅，每個(gè)處理重復(fù)3 次，18℃培養(yǎng)至對(duì)照長滿平板后，測(cè)量各處理菌落直徑，計(jì)算抑菌率，檢測(cè)不同溫度對(duì)試驗(yàn)菌株發(fā)酵濾液抑菌活性的影響。

1.2.5 拮抗菌發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性測(cè)定

拮抗菌無菌發(fā)酵濾液制備方法同1.2.4。取發(fā)酵濾液15mL 分別加入到20mL 直口離心管中，用1mol/L HCl 和1mol/L NaOH 分別調(diào)pH 至5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0，室溫靜置24h 后，將各管中的pH 調(diào)回至未經(jīng)處理的發(fā)酵濾液pH6.8。之后按照1∶5 的比例，將處理后的發(fā)酵濾液分別與滅菌后冷卻至55℃的PDA 培養(yǎng)基混合均勻制備平板。每個(gè)平板中央接種寄生水霉菌餅，不經(jīng)處理的發(fā)酵濾液作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次，18℃培養(yǎng)至對(duì)照長滿平板后，測(cè)量各處理菌落直徑，計(jì)算抑菌率，檢測(cè)不同pH 處理對(duì)試驗(yàn)菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選

試驗(yàn)以寄生水霉SMJ-1 為指示菌，通過平板對(duì)峙法篩選獲得1 株對(duì)水霉病原菌具有顯著拮抗作用的菌株YB5（圖1），其抑菌圈直徑達(dá)24.6mm，發(fā)酵液抑菌率達(dá)72.90%。該菌株對(duì)其他寄生水霉的拮抗作用試驗(yàn)結(jié)果顯示：該菌對(duì)不同來源的寄生水霉（SMJ-2、SMJ-3、SMJ-4）均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。

2.2 拮抗菌鑒定

2.2.1 拮抗菌YB5 的形態(tài)特征

菌株YB5 在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落呈圓形或不規(guī)則形，邊緣粗糙，表面粗糙褶皺，白色不透明（圖2）。顯微鏡下該菌革蘭氏染色陽性，細(xì)胞大?。?.5～1.8）×（0.5～0.6）μm，無莢膜，有芽孢。芽孢位于菌體中央，不膨大，柱狀，大小為（0.7～0.9）×（0.5～0.6）μm（圖3）。對(duì)照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，菌株YB5 的形態(tài)學(xué)特征與已知的芽孢桿菌屬Bacillus 一致。

2.2.2 拮抗菌YB5 的16S rRNA 序列分析

以菌株YB5 的基因組DNA 為模板，1492R/27F為通用引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)定獲得長度為1208 bp 的堿基序列（GenBank accession number：MN121126）。所測(cè)序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Blast 結(jié)果顯示，菌株YB5 與特基拉芽孢桿菌Bacillus tequilensis 的16S rRNA 序列相似性達(dá)99%。選取并下載典型菌株序列，以其近源屬雙芽孢桿菌屬Amphibacillus 模式種Amphibacillus sxylans 為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖4 所示，菌株YB5 與特基拉芽孢桿菌聚類在一個(gè)分支上，結(jié)合其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，菌株YB5 鑒定為特基拉芽孢桿菌。

2.3 拮抗菌傳代穩(wěn)定性測(cè)定

拮抗菌株YB5 和其傳代菌株發(fā)酵濾液的抑菌試驗(yàn)結(jié)果如表1。拮抗菌YB5 繼代培養(yǎng)菌株與出發(fā)菌株之間抑菌效果差異不顯著（P＞0.05），說明該拮抗菌抑菌效果傳代穩(wěn)定。

2.4 溫度變化對(duì)拮抗菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

溫度變化對(duì)菌株YB5 發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的影響結(jié)果如圖5 所示，10～70℃范圍內(nèi)樣品的抑菌活性無顯著性差異（P＞0.05），表明在此范圍內(nèi)溫度變化對(duì)菌株YB5 發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)的活性沒有影響，該菌株發(fā)酵液對(duì)溫度變化具有良好的耐受性。

2.5 拮抗菌發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性

pH 變化對(duì)YB5 發(fā)酵液抑菌活性的影響結(jié)果如圖6 所示。試驗(yàn)菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性對(duì)酸堿度變化較為敏感，pH＜7.0 或pH＞8.0，抑菌率顯著下降（P＜0.05），僅在pH7.0～8.0 范圍內(nèi)抑菌活性較為穩(wěn)定，表明菌株YB5 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的活性受pH影響較大，在pH7.0～8.0 范圍內(nèi)抑菌作用穩(wěn)定。

3 討論

目前，水霉病的防治仍然缺乏安全有效的方法，以化學(xué)藥物、抗生素、疫苗以及中草藥等進(jìn)行防治亦存在各自的缺點(diǎn)和不足。利用拮抗菌及其發(fā)酵產(chǎn)物能綠色、環(huán)保、安全、高效地防治水霉病，已成為水霉病防控研究的主流方向[3]。研究表明，一些細(xì)菌如芽孢桿菌和放線菌對(duì)水霉菌具有良好的抑制作用。張書俊[20]等篩選出一株能明顯抑制水霉菌菌絲體生長與孢子萌發(fā)的粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens 菌株LD038。賀鳳等[21]從海底沉積物中分離、篩選水霉拮抗菌株海洋鏈霉菌Streptomycesmarinensis S26，其產(chǎn)生的活性物質(zhì)對(duì)病原水霉真菌有較強(qiáng)的抑制作用，并對(duì)外界環(huán)境變化有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。梁永增[22]篩選的芽孢桿菌Bacillus sp.菌株JL04 和短小芽孢桿菌Bacillus pumilus JL50 對(duì)水霉菌均具有顯著抑制作用，兩株拮抗菌對(duì)魚體沒有毒性，且傳代穩(wěn)定。本研究從實(shí)驗(yàn)室分離保存的27 株細(xì)菌中篩選獲得一株對(duì)水霉具有顯著拮抗作用的芽孢桿菌菌株YB5。該菌株對(duì)不同來源的多株寄生水霉均顯示出明顯的抑制作用。對(duì)其形態(tài)學(xué)特征及16S rRNA 基因序列比對(duì)分析，可知菌株YB5 為芽孢桿菌屬的特基拉芽孢桿菌。該結(jié)果是特基拉芽孢桿菌對(duì)水霉菌具有拮抗作用的首次報(bào)道。

表1 YB5 及其繼代培養(yǎng)菌株對(duì)寄生水霉的抑制作用Tab.1 Inhibition rate of YB5 and its subculture against S.parasitica

特基拉芽孢桿菌YB5 經(jīng)傳代培養(yǎng)后，對(duì)水霉菌拮抗作用穩(wěn)定，表明其具有良好的傳代穩(wěn)定性。該菌發(fā)酵濾液經(jīng)10～70℃低溫及高溫處理后，抑菌活性穩(wěn)定。淡水養(yǎng)殖水體的溫度變化范圍一般為0～34.6℃[23]，菌株YB5 發(fā)酵產(chǎn)物表現(xiàn)出對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境溫度變化的良好適應(yīng)性。該菌的發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性對(duì)環(huán)境的pH 波動(dòng)較為敏感，僅在pH7～8 范圍內(nèi)具有與對(duì)照差異不顯著的抑菌效果。一般來說，淡水養(yǎng)殖水體的pH 變化范圍為6.8～8.5[24]，可見該菌的發(fā)酵產(chǎn)物在淡水養(yǎng)殖水體中也具有較好的酸堿適應(yīng)性。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究開發(fā)水霉病生防菌劑提供了優(yōu)質(zhì)菌種資源和基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，后續(xù)試驗(yàn)還將對(duì)該菌株的安全性及防治效果進(jìn)行測(cè)定，以期為該菌開發(fā)為新型生物菌劑奠定基礎(chǔ)。