郝晨光，舒斌，董揚(yáng)帆，魯耀鵬，鄭佩華，宮春光

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430000；3.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南 ?？?570100；4.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510000；）

泥鰍肉質(zhì)鮮美，既可食用，又可入藥，被稱為“水中人參”，是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的水產(chǎn)動(dòng)物。多種因素導(dǎo)致野生泥鰍的產(chǎn)量減少，市場(chǎng)需求卻較大，使人工養(yǎng)殖泥鰍呈現(xiàn)出了巨大的商機(jī)，必將成為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的新趨勢(shì)。

水產(chǎn)養(yǎng)殖中長途運(yùn)輸、標(biāo)記、催產(chǎn)等都不同程度地傷害魚類。使用麻醉劑可大幅度降低操作應(yīng)激，提高魚類的成活率。冰片又稱龍腦、龍腦香，為透明或半透明的中藥。目前市售的冰片多數(shù)為龍腦香的樹脂和揮發(fā)油中取得的結(jié)晶或化學(xué)合成產(chǎn)品[1]。冰片能通諸竅，散郁火，去翳明目，消腫止痛。冰片的醫(yī)學(xué)作用藥理已有一定研究[2-4]，但是，冰片作為麻醉劑對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的影響研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)方法研究了冰片對(duì)泥鰍的麻醉效果及對(duì)血液免疫指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

200 尾試驗(yàn)用泥鰍由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供，體質(zhì)量為（10±1）g，體長（4.0±0.5）cm。泥鰍運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室后，每50 尾為一組放入2L 水桶中暫養(yǎng)24h，不投喂。試驗(yàn)用曝氣3d 以上的自來水，水溫19～23℃，溶解氧5～6mg/L，pH6.7.0～7.4。

冰片麻醉劑的配制：冰片∶PEG-300 聚乙二醇∶黃芨多糖為1∶1∶100，用蒸餾水溶解，分別配制成7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L 和17g/L 的濃度備用。

試驗(yàn)用其他藥品包括：肝素鈉、Na2HP04、KH2P04、鉬酸銨、過氧化氫、鹽酸、無水乙醇、氫氧化鈉。試驗(yàn)用器材包括：吸耳球、電子天平、膠頭滴管、蒸餾水瓶、電爐（石棉網(wǎng)）、721 分光光度計(jì)、恒溫水箱、血紅蛋白比色計(jì)、計(jì)數(shù)器等。

1.2 方法

1.2.1 冰片對(duì)泥鰍麻醉效果實(shí)驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)設(shè)5 個(gè)冰片濃度：1g/L、5g/L、10g/L 和15g/L。預(yù)實(shí)驗(yàn)期間，用攝影機(jī)全程記錄泥鰍的狀態(tài)與反應(yīng)，以確定設(shè)置的濃度梯度的合理性。通過查閱文獻(xiàn)[4]，結(jié)合泥鰍的反應(yīng)特征，將麻醉過程分為六期（表1），復(fù)蘇過程分為四期（表2）。

預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，冰片對(duì)泥鰍的麻醉效果和對(duì)理化指標(biāo)影響的正式試驗(yàn)濃度應(yīng)在5～20g/L 之間（表3）。

正式試驗(yàn)的濃度梯度為：8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L 和17g/L，每個(gè)濃度3 個(gè)平行組和1 個(gè)對(duì)照組，每組3 尾泥鰍。

表1 冰片對(duì)泥鰍麻醉程度分期及其行為特征Tab.1 Anesthesia stages and behavior characteristics of borneol anesthetized loach

表2 被冰片麻醉的泥鰍復(fù)蘇過程分期及其行為特征Tab.2 Recovery stages and behavior characteristics of borneol anesthetized loach

表3 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The preliminary experimental results

1.2.2 冰片對(duì)泥鰍血液中血紅蛋白含量和過氧化氫酶活力影響試驗(yàn)

參考其他麻醉劑的研究方法[5-7]進(jìn)行試驗(yàn)，用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

血紅蛋白含量測(cè)定：尾靜脈采血，用Sahlis 比色法測(cè)定泥鰍血紅蛋白含量。

過氧化氫酶活力測(cè)定：同麻醉效果的實(shí)驗(yàn)。每盆放入4 尾體質(zhì)健康、規(guī)格相當(dāng)?shù)哪圉q。每組泥鰍達(dá)到深度麻醉10min 后開始尾靜脈采血。每組血量應(yīng)達(dá)到25mL，注入管中后放入4℃的冰箱中靜置冷藏4h，1000r/min 離心10min 至完全分層，取上清液為實(shí)驗(yàn)所需血清。然后準(zhǔn)備其他試劑：磷酸鹽緩沖液為67mmol/L，pH=7.4，基質(zhì)液為65μmol/L 的過氧化氫。稱取鉬酸銨20.2g，溶于500mL 蒸餾水中。將基質(zhì)液置于37℃的水中，水浴加熱5min，然后按表4步驟操作。

表4 操作步驟Tab.4 The operation steps

過氧化氫酶活力（U/L）=[（A對(duì)-A測(cè)）/A標(biāo)]×（65×1×1000/0.2×1000）

式中A對(duì)為對(duì)照管吸光度值，A標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值，A測(cè)為測(cè)定管吸光度值，65 為標(biāo)準(zhǔn)管H2O2體積，1000 換算成1L 血清，0.2 為血清用量，1000 為μmol 換算成mmol，最終單位換算為U·mL-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰片對(duì)泥鰍的麻醉效果

由表5 可知，隨著冰片濃度的增加，泥鰍進(jìn)入麻醉狀態(tài)所需的時(shí)間縮短，麻醉表現(xiàn)越明顯，復(fù)蘇時(shí)間越長。當(dāng)冰片濃度達(dá)到15g/L 及以上時(shí)，泥鰍出現(xiàn)劇烈應(yīng)激反應(yīng)，躍出水面，開始出現(xiàn)死亡。冰片濃度繼續(xù)加大，魚類的應(yīng)激反應(yīng)更劇烈，持續(xù)一會(huì)就越過前幾級(jí)麻醉，直接進(jìn)入深度麻醉。當(dāng)冰片濃度達(dá)到17g/L 時(shí)，泥鰍全部死亡，無法復(fù)蘇。

表5 冰片對(duì)泥鰍的麻醉效果Tab.5 Anesthetic effect of borneol on loach

2.2 冰片對(duì)泥鰍血液中血紅蛋白含量和過氧化氫酶活力的影響

由表6 可知：隨著冰片濃度的升高，泥鰍血液中血紅蛋白含量差異不顯著，但是血液中過氧化氫酶活力逐漸降低。冰片濃度在12～17g/L 時(shí)，過氧化氫酶活性顯著低于0～11g/L 各組；冰片濃度為14～17g/L時(shí)，過氧化氫酶活性顯著低于12g/L 和13g/L 兩組。

表6 冰片對(duì)泥鰍血液中血紅蛋白含量和過氧化氫酶活力的影響Tab.6 Effects of borneol concentrations on hemoglobin content and catalase activity in the blood of loach

3 討論

3.1 冰片對(duì)泥鰍的呼吸頻率和擺尾次數(shù)的影響

隨著冰片濃度不斷提供和麻醉程度的不斷加深，泥鰍呼吸頻率逐漸減緩，擺尾次數(shù)逐漸減少，這與其他魚類表現(xiàn)相同[8]。麻醉劑溶于水后，通過體表和鰓絲進(jìn)入泥鰍的血液循環(huán)系統(tǒng)，最終在泥鰍的大腦聚集。在一定時(shí)間內(nèi)，麻醉時(shí)間越長，血液中麻醉劑的含量越高，最終達(dá)到一個(gè)平衡的峰值狀態(tài)。此時(shí)，泥鰍表現(xiàn)為穩(wěn)定的深度麻醉。

3.2 冰片對(duì)泥鰍血液血紅蛋白含量的影響

麻醉前后和不同冰片濃度下，泥鰍血液中血紅蛋白含量無顯著差異。這顯示出了冰片與大多數(shù)麻醉劑和麻醉方法不同。如電麻醉方法就深刻影響魚類血液的諸多指標(biāo)。影響血紅蛋白含量的因素有許多，包括魚體的造血減弱、貧血、內(nèi)分泌紊亂、機(jī)體遭受機(jī)械性損傷而缺血、中毒、營養(yǎng)不良等[9，10]。本試驗(yàn)用的泥鰍健康，無任何機(jī)械損傷；試驗(yàn)前空腹，最大限度地排除其他干擾。據(jù)研究，人吸收冰片后，通過排便和出汗呼吸等方式排出體外，在體內(nèi)不易蓄積。冰片與以上列舉的影響血液血紅蛋白的因素沒有明顯關(guān)系，這可能是實(shí)驗(yàn)中泥鰍體內(nèi)血紅蛋白含量沒有顯著變化的原因。

3.3 冰片對(duì)泥鰍血液過氧化氫酶活力的影響

在冰片上述濃度下，泥鰍體內(nèi)的過氧化氫酶活性降低。研究表明，冰片對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，既能鎮(zhèn)定安神，又能提神醒腦[11，12]。本試驗(yàn)冰片濃度可能正好處于調(diào)節(jié)的臨界點(diǎn)，即鎮(zhèn)定作用時(shí)，泥鰍各項(xiàng)生命活動(dòng)趨于平緩，過氧化氫酶的活性也在降低，這可能與冰片的鎮(zhèn)定安神功效有關(guān)，限制了機(jī)體內(nèi)的某些代謝速率，影響了過氧化氫酶的合成。后來在較高的冰片濃度下，泥鰍出現(xiàn)了死亡狀況，這可能與過氧化氫酶含量降低，在泥鰍體內(nèi)蓄積有關(guān)。

3.4 小結(jié)

據(jù)研究，麻醉劑的理想濃度作用于動(dòng)物時(shí)，3 min之內(nèi)動(dòng)物即進(jìn)入麻醉狀態(tài)，5 min 之內(nèi)完全復(fù)蘇[8]。麻醉時(shí)間過短或過長都不能達(dá)到理想效果。冰片麻醉對(duì)泥鰍的血紅蛋白含量影響不大，但能影響泥鰍血液過氧化氫酶的活性，且在冰片濃度為14g/L 時(shí)，過氧化氫酶活力顯著降低。麻醉效果表明，冰片麻醉泥鰍的最佳濃度為14～15g/L。天然冰片在機(jī)體內(nèi)不易蓄積，對(duì)人體沒有明顯的毒副作用[13-15]，是一種天然安全高效的麻醉劑。但是，目前市場(chǎng)上充斥著大量的化學(xué)合成冰片，其藥理效果與天然冰片相差無幾，對(duì)人體有明顯的毒副作用，在使用化學(xué)合成的冰片時(shí)，應(yīng)注意控制濃度。而天然冰片目前市場(chǎng)上較少，價(jià)格略高，天然冰片作為麻醉劑適于較為珍貴或數(shù)量較少的魚類，以降低成本。