許元釗，張春梅，畢永紅，賀文芳，徐勇斌，李明

（1.大連海洋大學，遼寧 大連 116023；2.中國科學院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點試驗室，湖北 武漢 430072；3.金華市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江 金華 321017）

集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖對水生態(tài)環(huán)境的負面影響備受關(guān)注。飼料的過度投喂被認為是養(yǎng)殖水域富營養(yǎng)化和水體污染的重要原因：殘餌浪費資源，其中氮、磷溶失導致水質(zhì)惡化[1]；水溶性有機物、營養(yǎng)鹽迅速釋放進入水中增加水體的營養(yǎng)負荷，不溶性的剩余飼料在微生物作用下發(fā)酵腐爛釋放出各種影響水質(zhì)的物質(zhì)，共同構(gòu)成水質(zhì)污染，加劇水體富營養(yǎng)態(tài)勢[2]。

養(yǎng)殖水體的氮、磷排放和積累量是評價飼料氮、磷利用率、養(yǎng)殖水平及養(yǎng)殖模式的重要指標，也是環(huán)境污染和病害流行的重要原因之一[3]；殘餌、餌料溶失及其代謝產(chǎn)物的低降解率與積累是水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境失穩(wěn)的主要原因[4]；集約化養(yǎng)殖水體密度大、投餌量多，較低密度養(yǎng)殖水體更容易惡化。換水是養(yǎng)殖管理中常見的改善養(yǎng)殖環(huán)境的措施，這使得毗鄰養(yǎng)殖水域受到養(yǎng)殖廢水排放的影響[2]，可導致水體中浮游生物大量繁殖，水中氧溶量降低，產(chǎn)生多種毒素，嚴重者產(chǎn)生水華或赤潮，危害生態(tài)環(huán)境[5-8]。目前對于養(yǎng)殖廢水及其生態(tài)環(huán)境影響的關(guān)注越來越高，但關(guān)于養(yǎng)殖廢水污染成因的研究尚不多見。

要求對養(yǎng)殖廢水深度處置后達標排放的呼聲越來越高；利用微藻處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水，可以凈化水體，又可以獲得水產(chǎn)動物的綠色餌料，促進養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[9]，既可以實現(xiàn)養(yǎng)殖廢水的減排，又可以變廢為寶，探討廢物的資源化利用。如水體中不同形式的磷對普通小球藻生長的生物有效利用性[10]；培養(yǎng)微藻降低豬糞厭氧發(fā)酵廢水沼液對環(huán)境的污染[11]；利用從養(yǎng)殖污水中分離的蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidesa 處理養(yǎng)鴨廠污水，發(fā)現(xiàn)小球藻對養(yǎng)殖污水的處理有很好效果[12]。有人將不同濃度小球藻接種到草金魚Goldfish 的養(yǎng)殖廢水中，通過定期檢測水體水質(zhì)指標，確認了小球藻對養(yǎng)殖水體的凈化能力[13]。盡管諸多研究已經(jīng)確認了小球藻在養(yǎng)殖廢水處置中的作用，但小球藻生長對殘餌引起的營養(yǎng)釋放的直接凈化效果目前尚無直接的證據(jù)。

綜上所述，為確認殘餌對水質(zhì)的具體影響以及小球藻對殘餌釋放營養(yǎng)的吸收利用，本研究通過對比分析殘餌惡化水質(zhì)的具體效應(yīng)，確認索羅金小球藻對飼料釋放營養(yǎng)的凈化效果，以期為養(yǎng)殖水環(huán)境的管理以及養(yǎng)殖尾水處置提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

所用飼料選取江漢平原水產(chǎn)養(yǎng)殖戶常用的配合飼料，分別命名為HD、ZY 與FL，主要原料皆為魚粉、豆粕、小麥、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等，粗蛋白含量≥28%。實驗用水為實驗室純凈水和洪湖養(yǎng)殖原水。實驗接種用的小球藻來源于從野外環(huán)境中分離純化編號為GL6-2 的索羅金小球藻Chlorella sorokiniana，接種時用純凈水清洗3 次離心除去藻種中含有的營養(yǎng)鹽。

1.2 方法

飼料投入量依據(jù)實際生產(chǎn)的具體情況來定，每種飼料設(shè)置3 個平行，3 個空白對照。試驗分為2 個階段：第1 階段，1.0g 飼料加入2.0L 蒸餾水和過濾的養(yǎng)殖水中，浸泡96h，0h、1h、4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h 和96h 采樣測定水體中的氮磷含量[14]；用移液槍取各組表層處理液10mL，用0.45μm 濾膜過濾后，參照《水和廢水監(jiān)測分析方法（第4 版）》測定濾液中氮磷含量[15]。探究飼料在水體中釋放營養(yǎng)的情況。

第2 階段，將小球藻接種到通過1.2μm 濾膜過濾的第1 階段處理液中，考察小球藻去除氮磷及有毒物質(zhì)的能力。接種小球藻的OD680為2.0，接種量為50mL，光暗比為12∶12，培養(yǎng)光強為（45±5）μmol·m-2s-1，分別在0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d取樣測定OD680以及水體的氮磷含量等指標[14]。

試驗在光照培養(yǎng)箱中進行，溫度為（25±0.5）℃，每個容器均處于密封狀態(tài)。

硝酸鹽含量采樣分光光度法測定，氨態(tài)氮含量采用水楊酸分光光度法測定，亞硝酸鹽含量采用N-（1-萘基）一乙二胺光度法測定，磷酸鹽含量采用鉬酸銨分光光度法測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

通過測定不同濃度梯度的小球藻+處理液稀釋液的光密度和小球藻細胞密度及平均直徑，換算得到小球藻生物量與光密度（OD680）間的關(guān)系：生物量（g/L）=4.7639×OD680-0.0235，R2=0.9951。小球藻降低處理組水體中氮磷含量的能力用氮磷去除率表示[14]：去除率（%）=（1-處理后氮磷含量/處理前氮磷含量）×100%。

用Microsoft Excel 2013 計算試驗數(shù)據(jù)的平均值和標準誤，并制作折線圖。利用SPSS 19.0 進行數(shù)據(jù)分析。用單因素方差分析方法（one-way ANOVA）和LSD 多重比較分析不同處理間的顯著性。當P＜0.05，各組間數(shù)據(jù)差異顯著，當P＜0.01，各組間數(shù)據(jù)差異極顯著，當P＞0.05，各組間數(shù)據(jù)差異不顯著。

表1 96h 時各組水體中硝酸鹽、銨態(tài)氮以及亞硝酸鹽含量Tab.1 Contents of nitrate,ammonium nitrogen and nitrite in distilled water and aquaculture water in each group at 96 h/mg·L-1

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料氮的釋放

3 種飼料在投入兩類水體后，水體硝態(tài)氮、銨態(tài)氮以及亞硝態(tài)氮濃度變化規(guī)律基本一致，均呈逐漸升高的趨勢，對照組中無顯著變化（P＞0.05）（圖1）；其中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的濃度在0～24h 內(nèi)增加較慢，24～96h 時增加迅速，而亞硝態(tài)氮濃度在0～48h 內(nèi)增加較緩，在48～96h 時增加迅速。

在96h 時，各組水體中硝酸鹽、銨態(tài)氮以及亞硝態(tài)氮含量均顯著高于對照組（P＜0.05）（表1），其中FL 飼料組的釋放量最大，96h 時兩種水體中硝酸鹽的含量分別為（0.978±0.339）mg/L 與（1.577±0.339）mg/L，銨態(tài)氮為（1.068±0.142）mg/L與（1.679±0.722）mg/L，亞硝酸鹽均為（0.040±0.006）mg/L。HD與ZY 兩組釋放水平基本一致（P＞0.05）。

2.2 飼料磷的釋放

3 種飼料投入兩類水體后，水體磷酸鹽含量快速和勻速升高（圖2）。蒸餾水組中，磷酸鹽平均含量增至1.012mg/L，平均增加速率為0.010mg/（L·h）；養(yǎng)殖水組中，磷酸鹽平均含量從（0.007±0.001）mg/L增至（1.747±0.224）mg/L，平均增加了1.740mg/L，平均增加速率為0.018mg/（L·h），增加速度是蒸餾水組的1.8 倍。對照組水體中磷酸鹽含量基本無變化。在96h 時，各組水體中磷酸鹽含量均顯著高于對照組（P＜0.01）（表2）。

2.3 接種小球藻后水體中氮含量的變化

接種小球藻后，水體中硝酸鹽和銨態(tài)氮含量隨培養(yǎng)時間的延長而降低，亞硝酸鹽含量試驗前后基本無變化（圖3）。兩個處理組硝酸鹽、銨態(tài)氮含量降低趨勢基本一致，前3d 下降較快，后5d 下降較慢。蒸餾水處理組中亞硝酸鹽含量前4d 有所升高，后4d 緩慢降低，養(yǎng)殖水處理組試驗過程中亞硝酸鹽含量基本無變化。

表2 96h 時各組水體中磷酸鹽含量Tab.2 Phosphate contents in water of each group at 96 h

表3 試驗前后各組水體中硝酸鹽和銨態(tài)氮含量Tab.3 Contents of nitrate and ammonium nitrogen in water of each group before and after treatment the experiment

在試驗結(jié)束時，各組水體中硝酸鹽、銨態(tài)氮含量均顯著低于對照組（P＜0.01）（表3）。

蒸餾水處理組中硝酸鹽含量平均降低了0.648 mg/L，平均下降速率為0.081 mg/（L·d），銨態(tài)氮平均降低了1.535 mg/L，降低速率為0.192 mg/（L·d）。養(yǎng)殖水處理組中硝酸鹽含量平均降低了1.257 mg/L，平均下降速率為0.157 mg/（L·d），是蒸餾水組的1.94倍，銨態(tài)氮平均降低了0.595 mg/L，降低速率為0.074 mg/（L·d），是蒸餾水組的0.385 倍。對照組的硝酸鹽含量分別從1.040 mg/L 降至0.934 mg/L 和1.513 mg/L 增至2.062 mg/L，銨態(tài)氮含量試驗前后基本無變化。

2.4 接種小球藻后磷含量變化

表4 試驗前后各組水體中磷酸鹽含量Tab.4 Phosphate contents in the water in various groups before and after the treatment

水體中磷酸鹽含量隨接種小球藻后的時間延長而顯著降低（圖4），試驗結(jié)束時，各組水體中磷酸鹽含量均顯著低于對照組（P＜0.01）（表4）。

兩個處理組磷酸鹽含量降低趨勢基本一致，0～3d 下降較快，5～8d 下降較慢。蒸餾水處理組中，磷酸鹽含量平均降低了0.988 mg/L，下降速率為0.124 mg/（L·d）。養(yǎng)殖水組中，HD 和FL 組磷酸鹽含量先降低后升高再降低，ZY 組持續(xù)降低，三個飼料組總體水平上降低了1.120 mg/L，平均下降速率為0.140 mg/（L·d）。對照組磷酸鹽含量試驗前后基本無變化，蒸餾水處理組中從1.969 mg/L 微降至1.783 mg/L，養(yǎng)殖水組從1.690 mg/L 升至1.803 mg/L。

2.5 小球藻的生長

小球藻接種到兩個處理組后，在處理液中生長繁殖（圖5）。蒸餾水處理組小球藻OD680從接種時的（0.101±0.004）增至（0.548±0.099），增了0.446，日增殖速率為0.056。養(yǎng)殖水組OD680從（0.104±0.002）增至（0.758±0.131），增加了0.654，日增值速率為0.082。

試驗結(jié)束時，蒸餾水處理組中小球藻的生物量平均增加了2.126 g/L，養(yǎng)殖水處理組平均增加了3.115 g/L。

2.6 水體氮磷的去除

接種小球藻7d 后，蒸餾水處理組中硝酸鹽含量從（0.841±0.199）mg/L 降至（0.193±0.062）mg/L，降低了0.648 mg/L，去除率為77%；磷酸鹽含量從（1.589±0.306）mg/L 降至（0.601±0.223）mg/L，降低了0.988 mg/L，去除率為62%。養(yǎng)殖水處理組中硝酸鹽含量從（1.513±0.236）mg/L 降至（0.256±0.055）mg/L，降低了1.257 mg/L，去除率為83%；磷酸鹽含量從（1.985±0.362）mg/L 降至（0.865±0.306）mg/L，降低了1.120 mg/L，去除率為56%（表6）。

表5 小球藻在蒸餾水和養(yǎng)殖水處理組中的生物量Tab.5 Biomass of green alga Chlorella in distillate water and cultured water in the treatment groups/mg·L-1

表6 蒸餾水處理組和養(yǎng)殖水處理組中氮磷去除情況Tab.6 Nitrogen and phosphorus removal rates in distilled water treatment groups and culture water treatment groups

表7 蒸餾水處理組和養(yǎng)殖原水處理組中銨態(tài)氮和亞硝酸鹽去除情況Tab.7 Removal rates of ammonium nitrogen and nitrite in water in distilled water treatment groups and aquaculture water treatment groups

小球藻有較好的去除銨態(tài)氮能力，接種小球藻7d 后，蒸餾水處理組中銨態(tài)氮含量總體水平上從（1.659±0.532）mg/L 降低至（0.124±0.043）mg/L，減少了1.535mg/L，去除率為92%；養(yǎng)殖水處理組中銨態(tài)氮含量總體上從（0.668±0.139）mg/L 降至（0.073±0.019）mg/L，減少了0.595mg/L，去除率為89%。蒸餾水處理組中亞硝酸鹽含量在小球藻接種培養(yǎng)7d 后從（0.034±0.004）mg/L 升至（0.062±0.030）mg/L，增加了0.028 mg/L；養(yǎng)殖水組中從（0.024±0.007）mg/L 微降至（0.023±0.011）mg/L，去除率幾乎為零（表7）。

3 討論

3.1 飼料對水質(zhì)的影響

飼料投入水中后，一部分被水產(chǎn)動物攝食，另一部分在水流沖擊和浸泡下，其有機組分在細菌作用下分解成無機物，無機組分中的氮磷等營養(yǎng)鹽緩慢釋放到水中[16]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中投放的飼料所含的氮、磷僅有5.8%～21.7%和4%～8%被水生動物同化，其余排入水中或沉積在池底，殘余餌料和魚蝦等排泄物則成為水產(chǎn)養(yǎng)殖水中的主要污染物[17]。

實驗發(fā)現(xiàn)，隨著浸泡時間的延長，飼料粗蛋白逐漸下降，而水體總氨氮和總磷濃度逐漸升高：在25℃下浸泡24 h，水體中的總氨氮濃度達到0.590mg/L，總磷含量達到1.271mg/L[2]。4 種商品微顆粒飼料浸泡中營養(yǎng)物質(zhì)的溶失、浸泡液中有機氮及有機磷含量的差異對比表明，微顆粒飼料很快溶失入水中，浸泡液中溶解有機氮（DON）、溶解有機磷（DOP）迅速升高；各種飼料浸泡液中無機氮主要以NO3--N 形式存在[18]。

本試驗第1 階段結(jié)束時，3 種飼料處理水體中硝酸鹽平均含量已高達1.465 mg/L，磷酸鹽含量高達1.747 mg/L，遠超出《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》（GB 383—2002）所規(guī)定的限量。

測定發(fā)現(xiàn)，鮑Abalone 飼料浸泡水中氨氮含量隨飼料的浸泡時間增加而升高[19]。本試驗進行4h時，蒸餾水處理組中ZY 組和FL 組銨態(tài)氮含量已達到0.299 mg/L 和0.461 mg/L，養(yǎng)殖水的FL 組也高達0.326 mg/L；96h 時，蒸餾水處理組中銨態(tài)氮含量平均為1.200 mg/L，養(yǎng)殖水中為0.761 mg/L。過高的銨態(tài)氮會損害水生生物的重要器官，抑制其生長發(fā)育，甚至造成死亡。我國《漁業(yè)水質(zhì)標準》中規(guī)定的銨態(tài)氮安全范圍為≤0.2 mg/L[20]。本試驗水體中銨態(tài)氮含量已超過了大部分甲殼動物氨態(tài)氮的耐受范圍（≤0.5 mg/L）[20]。

在水中溶解氧的作用下，銨態(tài)氮被氧化成硝態(tài)氮，亞硝酸鹽是氧化過程的中間產(chǎn)物，養(yǎng)殖水體中的亞硝酸鹽對水生動物具有較強的毒性[21]。試驗過程中，水體中亞硝酸鹽含量一直處于較低水平，最高僅為0.046mg/L，在《漁業(yè)水質(zhì)標準》規(guī)定的安全范圍≤0.1 mg/L 內(nèi)。

3 種飼料在蒸餾水中硝態(tài)氮和磷酸鹽釋放速率分別為0.008 mg/（L·h）和0.010 mg/（L·h），在養(yǎng)殖水中分別為0.015 mg/（L·h）和0.018mg/（L·h），釋放速率是蒸餾水組的近兩倍。飼料在養(yǎng)殖水中營養(yǎng)物質(zhì)釋放更快。影響水體中有機質(zhì)氮磷釋放的環(huán)境因素，如溫度、擾動等在本試驗中沒有較大幅度的波動，對氮磷釋放起關(guān)鍵作用的是微生物。與蒸餾水相比，養(yǎng)殖水中含有大量的微生物。微生物會加速水體中有機質(zhì)的降解和營養(yǎng)鹽的釋放，且微生物量與水體中氮磷釋放均存在極顯著的相關(guān)性[22]。在靜止培養(yǎng)環(huán)境條件下，由于水有機物界面處的交換作用強度較大，微生物的活動得到加強，營養(yǎng)物質(zhì)在微生物的作用下促進了含氮和含磷物質(zhì)的迅速礦化，使無機態(tài)營養(yǎng)鹽濃度升高[23]。

3.2 小球藻對水質(zhì)的凈化

在光照條件下，藻類以CO2或有機碳為碳源，主動消耗水中的氮磷營養(yǎng)物質(zhì)以滿足自身生長的需要，同時釋放氧氣，增加水體中的溶解氧含量，提高水體質(zhì)量，減輕富營養(yǎng)化狀況[24，25]。小球藻利用光能將污染物變廢為寶，實現(xiàn)了廢棄物資源化利用[26]。本試驗在接種小球藻后，水體中的硝酸鹽、磷酸鹽含量都顯著降低。蒸餾水處理組中的硝酸鹽平均含量從0.841 mg/L 降低至0.193 mg/L，磷酸鹽從1.589 mg/L 降低至0.601 mg/L，去除率分別為77%和62%。養(yǎng)殖水組中硝酸鹽從1.513 mg/L 降至0.256 mg/L，磷酸鹽從1.608 mg/L 降至0.599 mg/L，去除率分別為83%和56%。小球藻良好的脫氮除磷能力在由飼料引起的高氮磷含量的養(yǎng)殖污水中同樣適用。

蛋白核小球藻在高銨態(tài)氮質(zhì)量濃度水體下更能發(fā)揮其吸收氨氮和亞硝態(tài)氮能力，隨著水體中銨態(tài)氮質(zhì)量濃度增高，蛋白核小球藻對其的去除率逐漸增大[26]。本實驗中兩個處理組水體中銨態(tài)氮含量（濃度）顯著降低。蒸餾水處理組中銨態(tài)氮平均含量從1.659 mg/L 降低至0.124 mg/L，養(yǎng)殖水組中銨態(tài)氮從0.668 mg/L 降低至0.073 mg/L，去除率分別為92%和89%，表明小球藻對受殘餌污染的水體具有較好的凈化效果。

小球藻生長過程中對氮（硝態(tài)氮與銨態(tài)氮）的吸收量遠大于磷（磷酸鹽），這是因為小球藻對氮源的需求較大，僅次于碳源[27]。

本試驗過程中，兩個處理中亞硝酸鹽平均含量變化很?。≒＞0.05）。蒸餾水中，亞硝酸鹽從（0.034±0.004）mg/L 增至（0.062±0.030）mg/L，平均增加了0.028 mg/L。養(yǎng)殖水中，從（0.024±0.007）mg/L 微降至（0.023±0.011）mg/L。這可能是小球藻的生物量達到一定密度時，營養(yǎng)物質(zhì)消耗量與水中能提供的量剛好處于短期的平衡，小球藻生長繁殖較好；小球藻密度繼續(xù)增大時，營養(yǎng)物質(zhì)等供不應(yīng)求，小球藻的生長繁殖受阻，其吸收利用水體亞硝酸鹽氮的作用無明顯變化[13]。

試驗結(jié)束時，兩個處理組中小球藻的生物量都有所增加，蒸餾水組每升水體增加了2.126g，養(yǎng)殖水組每升水體增加了3.115g，試驗利用小球藻除去水體中氮磷等營養(yǎng)鹽的同時，得到一定生物量的小球藻。

3.3 結(jié)論

飼料較長時間地浸泡會造成水體中硝酸鹽、磷酸鹽等營養(yǎng)鹽含量迅速升高，銨態(tài)氮等有害物質(zhì)會積累增加。索羅金小球藻能較好凈化餌料投入的劣質(zhì)水體。利用索羅金小球藻除去水體中氮磷等營養(yǎng)鹽的同時，可獲取一定生物量的小球藻。