莫湘濤，張依山，李勇軍

（河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院 1髖部疾病研究治療中心，2風(fēng)濕科，3檢驗(yàn)科，河南鄭州450046）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）臨床上一般表現(xiàn)為對(duì)稱性手足小關(guān)節(jié)或多關(guān)節(jié)侵襲性炎癥、晨僵、腫痛等，是以炎性滑膜為主的慢性系統(tǒng)性疾病，若治療不及時(shí)或不當(dāng)，常危及關(guān)節(jié)外器官，嚴(yán)重者甚至可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，致使關(guān)節(jié)功能障礙［1-2］。因此早期治療RA 以控制疾病進(jìn)展對(duì)改善患者生活質(zhì)量意義重大。硼替佐米（bortezomib，BTZ）作為蛋白酶體抑制劑（protease inhibitor，PI），治療多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤非常有效，還可用于治療自身免疫性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和RA 等［3-5］。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）能夠與靶基因3'端非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，降解靶基因或抑制其編碼蛋白，參與機(jī)體多種自身免疫或炎癥性疾病，比如miR-223在RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mono?nuclear cells，PBMC）中異常表達(dá)，與RA 活動(dòng)程度相關(guān)，有望成為診斷RA 的生物標(biāo)志物［6-7］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可激活procaspase-1，經(jīng)剪切轉(zhuǎn)化后形成具有生物活性的caspase-1，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子釋放［8］。還有研究顯示，miR-223能夠下調(diào)NLRP3水平，NLRP3為 miR-223 的靶基因［9］。然而 BTZ 能否通過調(diào)控miR-223 和NLRP3 參與人單核細(xì)胞促炎反應(yīng)還未見相關(guān)報(bào)道，因此本研究從RA 患者外周血分離單核細(xì)胞，以不同濃度脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）進(jìn)行體外誘導(dǎo)，再經(jīng)BTZ 處理后，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，以探究BTZ的作用機(jī)制。

材料和方法

1 試劑和儀器

BTZ（≥98%，貨號(hào)：B125789）和 LPS（貨號(hào)：L118716）購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；DMEM 培養(yǎng)液（貨號(hào)：90013）和胎牛血清（貨號(hào)：F8250）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；miR-223 及內(nèi)參照U6的引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號(hào)：EH0201）、IL-1β ELISA 試劑盒（貨號(hào)：EH0185）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（貨號(hào)：EH0302）及兔抗人cas?pase-1抗體（貨號(hào)：FNab01284）均購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；兔抗人NLRP3 抗體（貨號(hào)：K004108P）、兔抗人細(xì)胞因子信號(hào)抑制物1（suppres?sor of cytokine signaling 1，SOCS1）抗體（貨號(hào)：K005441P）和兔抗人含SH2 結(jié)構(gòu)域的肌醇磷酸酶1（SH2 domain-containing inositol phosphatase-1，SHIP-1）抗體（貨號(hào)：bs-3567R-1）均購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司。Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀和Ap?plied Biosystems ProFlex PCR 擴(kuò)增儀均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；K8300 全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自南京世研儀器設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 RA 患者外周血的采集和單核細(xì)胞分離培養(yǎng)外周血標(biāo)本均取自本院10 例RA 患者，且半年內(nèi)均未使用免疫調(diào)節(jié)性藥物。所有患者及家屬均對(duì)本研究知情，并簽訂臨床研究協(xié)議書，本研究經(jīng)本院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。收集RA 患者外周抗凝血，加入淋巴細(xì)胞分離液，使用密度梯度離心法分離出PBMC，按照試劑使用說明書，使用MidiMACS 免疫磁性吸附柱分離裝置對(duì)PBMC 進(jìn)一步分離，人CD14+磁珠分選單核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD14+單核細(xì)胞得率＞95%可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并在光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)。將分離出的單核細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、相對(duì)濕度98%的培養(yǎng)箱中，隔天換液，胰酶消化傳代。

2.2 LPS 誘導(dǎo)單核細(xì)胞 收集培養(yǎng)的單核細(xì)胞，用DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×108/L，接種至24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，隨后加入1 mL含有 LPS（終濃度為 10 mg/L）［10］的 DMEM 培養(yǎng)液，設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，分別誘導(dǎo)6、12、24 和48 h，誘導(dǎo)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，加入含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，以確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

2.3 BTZ 處理LPS 誘導(dǎo)后的單核細(xì)胞 選取經(jīng)LPS在最佳誘導(dǎo)時(shí)間處理后的單核細(xì)胞，用DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×108/L，接種至24 孔板中，隨后加入1 mL含有BTZ（終濃度分別為5、10、25、50和100 nmol/L）［11］的 DMEM 培養(yǎng)液，設(shè)置 6 個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng) 24 h，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定上清液中 IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平，以確定BTZ 最佳處理濃度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組為：（1）對(duì)照組（未經(jīng)LPS 誘導(dǎo)）；（2）LPS 誘導(dǎo)組（單核細(xì)胞經(jīng)LPS 誘導(dǎo)24 h）；（3）BTZ 組（50 nmol/L BTZ處理LPS誘導(dǎo)后的單核細(xì)胞）。

2.4 ELISA 法測(cè)定單核細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平 收集處理后或未經(jīng)處理的單核細(xì)胞上清液，采用 ELISA 法檢測(cè)上清液中 IL-6、IL-1β 和TNF-α水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

2.5 RT-qPCR 法測(cè)定單核細(xì)胞中miR-223 水平使用TRIzol 法提取各組單核細(xì)胞中總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作反轉(zhuǎn)錄得cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系：1μL RT Enzyme Mix Ⅰ，1μL Random 6-mers，4μL 5× PrimeScript Buffer，2 μL Oligo（dT）Primer，10μL RNase-free ddH2O，2 μL 總RNA。以 cDNA 為模板進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。miR-223 上游引物序列為5'-CAGAAAGCCCAATTCCATCT-3'，下游引物序列為5'-GGGCAAATGGATACCATACC-3'；內(nèi)參照 U6 上游引物序列為5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下游引物序列為5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。反應(yīng)體系（20 μL）：0.8 μL fluorescent probe so?lution，1.0μL DNA 模板，上、下游引物各2μL，0.4μL ROX Reference Dye（50×），10.0 μL Premix Ex TaqTM，3.8 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：94℃ 2 min；94℃30 s，58℃ 60 s，68℃ 2 min，40 個(gè)循環(huán)；68℃ 8 min。確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算miR-223相對(duì)表達(dá)水平，每個(gè)樣本重復(fù)6次。

2.6 Western blot 法測(cè)定單核細(xì)胞中 NLRP3、cas?pase-1、SOCS1 和 SHIP-1 蛋白水平 用 RIPA 蛋白裂解液充分裂解各組單核細(xì)胞，離心取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白含量，以50 mg 樣品進(jìn)行上樣，行SDSPAGE，電轉(zhuǎn)膜，室溫下50 g/L 牛血清白蛋白封閉結(jié)合位點(diǎn) 2 h，加入 I 抗（NLRP3、caspase-1、SOCS1、SHIP-1 和β-actin 抗體），4℃下孵育過夜，加入羊抗兔IgG/HRP，25℃避光孵育1 h，曝光、顯色后觀察。使用凝膠成像軟件Image Lab分析灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組比較行單因素方差分析，任意兩組相比行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 單核細(xì)胞形態(tài)觀察

未經(jīng)LPS 誘導(dǎo)的單核細(xì)胞呈類球形，分布均勻，形態(tài)規(guī)整；經(jīng)LPS 誘導(dǎo)24 h 后，細(xì)胞多呈梭形、聚集狀，見圖1。

Figure 1.Morphological changes of monocytes without LPS induc?tion and after LPS induction for 24 h.Scale bar=50μm.圖1 未經(jīng)LPS誘導(dǎo)與LPS誘導(dǎo)24 h后的單核細(xì)胞形態(tài)圖

2 LPS 誘導(dǎo)不同時(shí)間對(duì)單核細(xì)胞炎癥因子分泌水平的影響

與未經(jīng)LPS誘導(dǎo)（0 h）相比，LPS誘導(dǎo)6、12、24和48 h后，單核細(xì)胞上清液IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高（P＜0.05），且呈時(shí)間依賴性，誘導(dǎo)24 和48 h后IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用LPS 誘導(dǎo)24 h 后的單核細(xì)胞，見圖2。

Figure 2.Effect of LPS induction for different time on the levels of inflammatory factors secreted by monocytes.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs 0 h；*P＜0.05 vs 6 h；△P＜0.05 vs 12 h.圖2 LPS誘導(dǎo)不同時(shí)間對(duì)單核細(xì)胞炎癥因子分泌水平的影響

3 不同濃度BTZ 對(duì)LPS 誘導(dǎo)后單核細(xì)胞炎癥因子分泌水平的影響

與未經(jīng) BTZ 處理相比，經(jīng) 5、10、25、50 和 100 nmol/L BTZ 處理后，單核細(xì)胞上清液 IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，50和 100 nmol/L BTZ 處理后 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用50 nmol/L BTZ處理LPS誘導(dǎo)后的單核細(xì)胞，見圖3。

Figure 3.Effects of different concentrations of BTZ on secretion of inflammatory factors by monocytes after LPS induc?tion.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 nmol/L；#P＜0.05 vs 5 nmol/L；△P＜0.05 vs 10 nmol/L；▲P＜0.05 vs 25 nmol/L.圖3 不同濃度BTZ 對(duì)LPS 誘導(dǎo)后單核細(xì)胞炎癥因子分泌水平的影響

4 各組單核細(xì)胞中miR-223 水平和NLRP3 蛋白水平的比較

與對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)組miR-223水平顯著降低，NLRP3 蛋白水平顯著升高（均P＜0.05）；與LPS誘導(dǎo)組相比，BTZ 組miR-223 水平顯著升高，NLRP3蛋白水平顯著降低（均P＜0.05），見圖4。

Figure 4.Comparison of miR-223 level（A）and NLRP3 protein level（B）in monocytes of each group.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS induc?tion group.圖4 各組單核細(xì)胞中miR-223 水平和NLRP3 蛋白水平的比較

5 各組單核細(xì)胞中 caspase-1、SOCS1 和 SHIP-1 蛋白水平的比較

與對(duì)照組相比，LPS 誘導(dǎo)組 SOCS1 和 SHIP-1 蛋白水平顯著降低，caspase-1 蛋白水平顯著升高（均P＜0.05）；與LPS誘導(dǎo)組相比，BTZ組SOCS1和SHIP-1 蛋白水平顯著升高，caspase-1 蛋白水平顯著降低（均P＜0.05），見圖5。

Figure 5.Comparison of caspase-1，SOCS1 and SHIP-1 protein levels in monocytes of each group.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS induction group.圖5 各組單核細(xì)胞中caspase-1、SOCS1 和SHIP-1 蛋白水平的比較

討 論

RA 發(fā)病機(jī)制和病因尚不明確，學(xué)術(shù)界認(rèn)為其發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程與炎癥反應(yīng)相關(guān)，大量研究資料表明，成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞和單核細(xì)胞可在外來因素刺激下，釋放大量炎癥因子，參與RA 進(jìn)程［12-13］。LPS 是一種炎癥調(diào)節(jié)因子，RA 患者外周血單核細(xì)胞對(duì)LPS 刺激反應(yīng)性增高。本研究用不同濃度LPS 誘導(dǎo)，24 h 后的單核細(xì)胞多呈梭形、聚集狀，提示經(jīng)LPS 誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生一定改變；檢測(cè)相關(guān)炎癥因子水平顯示，與未經(jīng)LPS誘導(dǎo)相比，LPS誘導(dǎo)6、12、24 和 48 h 后，單核細(xì)胞上清液 IL-6、IL-1β 和 TNF-α水平升高，提示LPS 誘導(dǎo)后，單核細(xì)胞炎癥因子分泌增加。研究報(bào)道，BTZ可用于治療RA合并多發(fā)性骨髓瘤，且無副作用［4］。本研究顯示，與 LPS 誘導(dǎo)組相比，BTZ 組單核細(xì)胞IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平降低，提示BTZ可以抑制人單核細(xì)胞中炎癥因子的分泌。

近幾年，miR-223 在機(jī)體炎癥反應(yīng)中的異常表達(dá)受到廣大學(xué)者們的關(guān)注，研究顯示，miR-223 在輻射性肺損傷組織中高表達(dá)，而NLRP3 低表達(dá)，miR-223 可能通過下調(diào)NLRP3 水平從而抑制IL-1β、IL-18和 caspase-1 表達(dá)，以減輕炎癥反應(yīng)［14］。屈紅林等［15］研究顯示有氧運(yùn)動(dòng)可上調(diào)慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）抑郁小鼠海馬組織中miR-223 水平，下調(diào)NLRP3 水平，從而緩解CUMS 抑郁小鼠海馬組織炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步探究顯示，miR-223能夠靶向調(diào)控NLRP3水平，參與炎癥性腸病進(jìn)程［16］。本研究顯示，與對(duì)照組相比，LPS 誘導(dǎo)組 miR-223 水平降低，NLRP3 水平升高，而與 LPS 誘導(dǎo)組相比，BTZ 組 miR-223 水平顯著升高，NLRP3 水平顯著降低，說明BTZ 可上調(diào)miR-223 水平，抑制NLRP3 表達(dá)，可能通過此機(jī)制拮抗LPS 刺激后單核細(xì)胞的促炎反應(yīng)。SOCS1 和SHIP-1 是LPS 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控蛋白，其水平越低提示炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重［17］。caspase-1 是 NLRP3 炎癥通路的下游蛋白，NLRP3 可激活caspase-1，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α 等炎癥因子［18］。本研究顯示，與對(duì)照組相比，LPS 誘導(dǎo)組 SOCS1 和 SHIP-1 水平降低，caspase-1 水平 升高 ，而 與 LPS 誘 導(dǎo)組 相 比 ，BTZ 組 SOCS1 和SHIP-1 水平升高，caspase-1 水平降低，提示 BTZ 可能通過上調(diào) SOCS1 和 SHIP-1 水平，下調(diào) caspase-1 水平，從而抑制LPS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞促炎反應(yīng)。

綜上所述，BTZ 可能通過阻斷miR-223/NLRP3軸活性，下調(diào) IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平，減少 LPS 誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞炎癥因子分泌。但本研究?jī)H進(jìn)行體外觀察，后期還應(yīng)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析BTZ 相應(yīng)機(jī)制，以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論。