孫新鋒，韓志毅，馮文杏，馬文峰，張 衛(wèi)，周小舟

［廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院（深圳市中醫(yī)院）肝病科，廣東深圳518033］

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC；簡稱“肝癌”）是全球第六大最常見的惡性腫瘤，更是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的第三大原因［1］。由于肝癌的早期有效診斷較為困難，僅20%肝癌患者能夠通過肝移植、手術(shù)切除或消融治療，部分患者甚至出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移；晚期肝癌患者預(yù)后較差，死亡率高［2］，因此探討新的輔助療法至關(guān)重要。丹皮酚（paeonol，Pae）別名牡丹醇，是牡丹花根皮提取物的主要活性成分，具有鎮(zhèn)靜催眠、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化等多種藥理和生理作用［3］。此外，丹皮酚還具有抑制腫瘤形成、降低腫瘤轉(zhuǎn)移能力的作用［4-5］。但丹皮酚對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響尚不清楚。微小RNA-424-3p（microRNA-424-3p，miR-424-3p）是一種與肝癌相關(guān)的關(guān)鍵mi?croRNA，與端粒維持、蛋白泛素化、組蛋白代謝等多個生物學(xué)過程密切相關(guān)［6］。研究顯示白藜蘆醇通過上調(diào) miR-424-3p 表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡［7］，但miR-424-3p 在肝癌中的作用并未被闡明。我們推測丹皮酚對肝癌的抗腫瘤作用可能與調(diào)控miR-424-3p表達(dá)有關(guān)，因此本研究通過觀察丹皮酚對肝癌細(xì)胞活力、遷移能力及miR-424-3p表達(dá)的影響，初步揭示丹皮酚抗腫瘤作用的分子機(jī)制，以期為丹皮酚在肝癌輔助治療中的應(yīng)用奠定理論依據(jù)。

材料和方法

1 細(xì)胞與試劑

人HCC細(xì)胞株Hep3B購于中國科學(xué)院細(xì)胞研究所。DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購于HyClone；Lipo?fectamineTM2000、青-鏈霉素雙抗和Trizol 試劑購于Invitrogen；Transwell 小室購于BD；抗磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）抗體和抗磷酸化的蛋白激酶B（phos?phorylated protein kinase B，p-AKT）抗體購于上海賽信通公司；抗細(xì)胞周期素D1（cyclin D1）抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）抗體、抗MMP9 抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG 購于上海艾博抗公司；miR-424-3p 模擬物（miR-424-3p mimics）、模擬物陰性對照（miR-NC）、抑制物陰性對照（anti-miR-NC）和miR-424-3p 抑制物（antimiR-424-3p）由上海吉瑪制藥公司提供；細(xì)胞計數(shù)試劑盒 8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒購于上海碧云天公司。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組 采用含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Hep3B 細(xì)胞。取對數(shù)生長期的Hep3B 細(xì)胞進(jìn)行實驗，采用含不同濃度（50、10、200 和400 mg/L）丹皮酚的細(xì)胞培養(yǎng)液干預(yù)Hep3B 細(xì)胞24 h，CCK-8 法檢測細(xì)胞活力，計算細(xì)胞相對活力，以確定丹皮酚的最佳使用濃度。將細(xì)胞分為：正常對照（normal control，NC）組（正常培養(yǎng)的Hep3B細(xì)胞）、丹皮酚組（采用丹皮酚濃度為200 mg/L 的細(xì)胞培養(yǎng)液干預(yù)細(xì)胞24 h）、miR-NC 組（將miR-NC 瞬時轉(zhuǎn)染至Hep3B 細(xì)胞）、miR-424-3p 組（將miR-424-3p mimics 瞬時轉(zhuǎn)染至Hep3B 細(xì)胞）、丹皮酚+anti-miRNC 組（轉(zhuǎn)染 anti-miR-NC 同時采用 200 mg/L 的丹皮酚干預(yù)處理）和丹皮酚+anti-miR-424-3p 組（轉(zhuǎn)染an?ti-miR-424-3p 同時采用200 mg/L 的丹皮酚干預(yù)處理）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000 使用說明書步驟進(jìn)行。

2.2 RT-qPCR 檢測miR-424-3p 的表達(dá)水平 待細(xì)胞按照上述分組進(jìn)行干預(yù)后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3 次，采用Trizol 試劑提取細(xì)胞RNA，紫外分光光度計測定RNA 濃度，調(diào)整A260與A280比值在1.8～2.0 之間。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進(jìn)行實時定量PCR 擴(kuò)增。miR-424-3p 的上游引物序列為 5′-CGCAAAACGTGAG?GCGCT-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′；內(nèi)參照U6 的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物序列為 5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。運用 2-ΔΔCt法分析miR-424-3p的表達(dá)水平。

2.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力 將Hep3B 細(xì)胞按照每孔1×104的密度接種于96孔板，按照細(xì)胞分組進(jìn)行干預(yù)后，每孔加入10μL 的CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處各孔的A值，換算為細(xì)胞相對活力。

2.4 Transwell 法檢測細(xì)胞遷移能力 待細(xì)胞按照上述分組進(jìn)行干預(yù)后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3 次，采用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L。將Transwell 小室至于24 孔板中，上室加入300 μL 細(xì)胞懸液，24 孔板下室加入500 μL 含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱孵育24 h 后，取出小室，棉簽拭去上室未遷移細(xì)胞，4%多聚甲醛固定下室膜10 min，結(jié)晶紫染色5 min，PBS 沖洗晾干后，倒置于顯微鏡下拍照，隨機(jī)選取5 個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，拍照，以其均值表示細(xì)胞遷移數(shù)目。

2.5 Western blot 檢測 cyclin D1、MMP2、MMP2 及PI3K/AKT 信號通路相關(guān)蛋白的水平 待細(xì)胞按照上述分組進(jìn)行干預(yù)后，收集各組細(xì)胞，常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法定量后，將細(xì)胞蛋白和上樣緩沖液混合，沸水浴5 min變性，按照每泳道30μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE。隨后將細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶常溫封閉膜1 h，再與稀釋的Ⅰ抗室溫孵育2 h，與稀釋的Ⅱ抗室溫孵育1 h 后，最后于暗室進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色。以β-actin 為內(nèi)參照，ImageJ 軟件測定各目的條帶的灰度值，分析cyclin D1、MMP2 和MMP2 的相對表達(dá)水平。為檢測丹皮酚調(diào)控miR-424-3p 表達(dá)對PI3K/AKT 信號通路的影響，按照上述方法檢測p-PI3K和p-AKT蛋白的水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度丹皮酚對Hep3B細(xì)胞活力的影響

與NC 組比較，丹皮酚組Hep3B 細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），且隨著丹皮酚濃度的逐漸增加，其對細(xì)胞活力的抑制作用逐漸增強(qiáng)，見圖1。我們選擇200 mg/L的丹皮酚進(jìn)行后續(xù)研究。

2 丹皮酚對Hep3B 細(xì)胞遷移能力和miR-424-3p 表達(dá)水平的影響

與NC 組比較，丹皮酚組Hep3B 細(xì)胞的MMP2 和MMP9蛋白表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞遷移數(shù)量顯著減少，而miR-424-3p表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖2和表1。

Figure 1.Effect of different concentrations of paeonol（Pae）on the viability of Hep3B cells.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs normal control（NC）group.圖1 不同濃度丹皮酚對Hep3B細(xì)胞活力的影響

Figure 2.Effect of paeonol（Pae）on the migration ability and the protein expression of MMP2 and MMP9 in Hep3B cells.A：the cell migration ability was determined by Transwell assay（crystal violet staining，×100）；B：the protein expression was detected by Western blot.圖2 丹皮酚對Hep3B 細(xì)胞遷移能力及MMP2 和MMP9 蛋白表達(dá)水平的影響

3 過表達(dá)miR-424-3p 對Hep3B 細(xì)胞活力和遷移能力的影響

與 miR-NC 組比較，miR-424-3p 組 Hep3B 細(xì)胞miR-424-3p 的表達(dá)水平顯著升高，cyclin D1、MMP2和MMP2 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞遷移數(shù)目顯著降低（P＜0.05），見圖3和表2。

表1 丹皮酚對Hep3B 細(xì)胞遷移、miR-424-3p 表達(dá)及MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平的影響Table 1.Effects of paeonol（Pae）on migration of Hep3B cells，miR-424-3p expression，and MMP2 and MMP9 pro?tein expression in Hep3B cells（Mean±SD. n=9）

Figure 3.Effect of miR-424-3p over-expression on the migration ability and the protein expression of MMP2，MMP9 and cyclin D1 in Hep3B cells.A：the cell migration ability was determined by Transwell assay（crystal vio?let staining，×100）；B：the protein expression was de?tected by Western blot.圖3 過表達(dá)miR-424-3p 對Hep3B 細(xì)胞遷移能力及MMP2、MMP9和cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

4 抑制miR-424-3p 表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)丹皮酚對Hep3B細(xì)胞活力和遷移能力的影響

與丹皮酚+anti-miR-NC 組比較，丹皮酚+antimiR-424-3p 組 Hep3B 細(xì)胞 miR-424-3p 的表達(dá)水平顯著降低，cyclin D1、MMP2 和 MMP2 蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，細(xì)胞遷移數(shù)目顯著增多（P＜0.05），見圖4和表3。

5 PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白水平的變化

與NC組比較，丹皮酚組Hep3B細(xì)胞p-PI3K和p-AKT 蛋白的水平顯著降低；與丹皮酚+anti-miR-NC組比較，丹皮酚+anti-miR-424-3p 組Hep3B 細(xì)胞p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

表2 過表達(dá)miR-424-3p 對Hep3B 細(xì)胞遷移能力及MMP2、MMP9和cyclin D1蛋白表達(dá)的影響Table 2.Effect of miR-424-3p over-expression on the migration ability and the protein expression of MMP2，MMP9 and cyclin D1 in the Hep3B cells（Mean±SD. n=9）

Figure 4.Inhibition of miR-424-3p partially reversed the effect of paeonol（Pae）on the migration ability and the pro?tein expression of MMP2，MMP9 and cyclin D1 in the Hep3B cells.A：the cell migration ability was deter?mined by Transwell assay（crystal violet staining，×100）；B：the protein expression was detected by Western blot.圖4 抑制miR-424-3p 部分逆轉(zhuǎn)丹皮酚對Hep3B 細(xì)胞遷移能力和MMP2、MMP9和cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

表3 抑制miR-424-3p 部分逆轉(zhuǎn)丹皮酚對Hep3B 細(xì)胞活力、遷移及MMP2、MMP9和cyclin D1蛋白表達(dá)的影響Table 3.Inhibition of miR-424-3p expression partially reversed the effect of paeonol（Pae）on the viability，migration ability and protein expression of MMP2，MMP9 and cyclin D1 in the Hep3B cells（Mean±SD. n=9）

Figure 5.The protein levels of p-PI3K and p-AKT in the Hep3B cells were determined by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs Pae+anti-miRNC group.圖 5 Western blot 檢 測 Hep3B 細(xì)胞中 p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的水平

討 論

據(jù)報道，全球每年約70 萬人死于肝癌［8］。盡管肝癌診療手段不斷發(fā)展，但肝癌的頻繁復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移率仍是影響肝癌患者生存率的主要因素。丹皮酚是一種廣譜抗腫瘤藥物。研究顯示，丹皮酚在體內(nèi)外對前列腺癌細(xì)胞生長均有抑制作用［9］；丹皮酚還可通過激活caspase-3途徑和下調(diào)生存素表達(dá)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡［10］；丹皮酚通過下調(diào)胃癌細(xì)胞MMP2和MMP9 表達(dá)具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、遷移和侵襲的作用［11］。此外，丹皮酚還可通過抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用［12］，但其對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響尚未可知。本研究采用不同濃度丹皮酚干預(yù)Hep3B 細(xì)胞，結(jié)果顯示丹皮酚呈劑量依賴性地抑制Hep3B 細(xì)胞活力，與既往研究結(jié)果一致［13］。進(jìn)一步研究顯示丹皮酚還可抑制MMP2 和MMP9 表達(dá)，降低Hep3B 細(xì)胞的遷移能力。這些結(jié)果提示丹皮酚具有抗肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

miR-424-3p 在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)，與非小細(xì)胞肺癌患者病情進(jìn)展和總體預(yù)后明顯相關(guān)，上調(diào)miR-424-3p 明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［14］；miR-424-3p在前列腺癌中表達(dá)下調(diào)，與臨床生存期和侵襲性表型顯著相關(guān)［15］。本研究顯示丹皮酚干預(yù)后Hep3B 細(xì)胞miR-424-3p 的表達(dá)水平顯著升高，提示丹皮酚的抗腫瘤作用可能與上調(diào)miR-424-3p 表達(dá)有關(guān)。過表達(dá) miR-424-3p 后 Hep3B 細(xì)胞 cy?clin D1、MMP2 和 MMP9 表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活力和遷移能力顯著降低，與丹皮酚的抗腫瘤作用一致。進(jìn)一步研究顯示，抑制miR-424-3p 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)丹皮酚對Hep3B 細(xì)胞活力和遷移能力的影響。這提示丹皮酚通過上調(diào)miR-424-3p表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的活力和遷移能力。

PI3K/AKT 信號通路在多種腫瘤存在異?；罨?，與腫瘤細(xì)胞的生長、代謝、增殖和轉(zhuǎn)移密不可分。研究顯示索菲拉尼通過抑制PI3K/AKT 信號通路活化可抑制肝臟腫瘤的生長［16］；白藜蘆醇通過抑制PI3K/AKT 通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移［17］。Xu 等［18］研究顯示miR-424-3p對前列腺癌細(xì)胞的抗增殖作用可能與抑制PI3K/Akt 通路有關(guān)。此外，丹皮酚還可通過抑制PI3K/Akt通路促進(jìn)放射誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞凋亡［19］。本研究顯示丹皮酚干預(yù)后Hep3B細(xì)胞PI3K和AKT 的磷酸化水平顯著降低，PI3K/AKT 信號通路受到抑制，而抑制miR-424-3p 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)丹皮酚對Hep3B 細(xì)胞PI3K/AKT 信號通路的抑制作用。這提示丹皮酚在肝癌中的抗腫瘤作用與調(diào)控PI3K/AKT通路有關(guān)。

總之，丹皮酚可上調(diào)miR-424-3p 表達(dá)和抑制PI3K/AKT 信號通路，進(jìn)而有效抑制肝癌細(xì)胞的活力和遷移。本研究為丹皮酚在肝癌輔助治療中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。