骨髓增殖性腫瘤患者不同預后與DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變的分析

何 瑛，魏學花

骨髓增殖性腫瘤(MPN)是以骨髓造血干細胞的過度增殖為主要特征的惡性腫瘤之一[1]，其主要包括慢性粒細胞白血病、真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥以及原發(fā)性骨髓纖維化[2]。目前對于骨髓增殖性腫瘤疾病的發(fā)病機制尚不明確，隨著基因測序手段的不斷提升，越來越多研究顯示，骨髓增殖性腫瘤與多種基因的突變相關[3]。DNA甲基轉移酶3A(DNMT3A)與組蛋白以及DNA的合成具有重要的作用，DNMT3A基因突變存在于多種惡性血液病中，且參與惡性血液病的發(fā)生、發(fā)展。MPL W515對于調控DNA的修飾具有重要作用，MPL W515突變可繼發(fā)激活JAK-STAT等信號轉導通路，引起MPN發(fā)生。JAK2 exon12突變與腫瘤的進展以及增殖具有重要聯(lián)系。研究報道顯示[4]，DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因的突變與骨髓增殖性腫瘤患者的危險層級相關，同時根據(jù)患者的基因突變以及危險分級，及時采取相應的干預措施，可提升患者的治療效果，本研究通過對MPN患者DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變率、突變類型的檢測，分析其與預后的關系，為臨床治療奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本次研究對象均來自于2010年2月-2015年4月在銀川市第一人民醫(yī)院治療的骨髓增殖性腫瘤患者，共120例，其中，男性57例，女性63例；50歲以下27例，51～60歲51例，61～70歲42例；病程0～2年59例，3～5年61例.根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)診斷以及分類標準，真性紅細胞增多癥(PV)患者31例，原發(fā)性血小板增多癥(ET)患者29例，原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)患者12例，慢性髓性白血病患者(CML)48例；根據(jù)核型分析結果顯示，預后良好組患者56例，中度風險組患者42例，不良風險組患者22例。本研究經(jīng)銀川市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者或其家屬均對此次研究知情且簽署知情同意書。

納入標準：①所有患者均符合骨髓增殖性腫瘤診斷標準[5]；②所有患者入院前均未進行抗腫瘤治療；③患者均未有腫瘤遠處轉移；④已獲得患者及家屬知情同意。排除標準：①嚴重心臟、肝、腎功能障礙的患者；②入院前3個月內服用過糖皮質激素或受體拮抗劑類藥物；③中途停止治療或者轉院患者。

1.2 研究方法：基因檢測，分別對所有患者采集外周血4 mL，3 500 r/min離心15 min，棄去上清液，加入等體積的異丙醇，以Trizol試劑進行總RNA提取，以PCR方法進行擴增，DNMT3A檢測上游引物設定為5′-TACATCTGGCTACTGGGTGTCGTATC-3′，下游引物設定為：5′-TCGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，MPL W515檢測的上游引物設定為5′-CCGCTCGAGCCCTCCCCCAAAC-3′，下游引物設定為5′-GAATGCGGCCGCCTGGGAGTGGTAAAAGGGGAGGAT-3′，JAK2 exon12上游引物設定為5′-ACACTCCAGCTGGGTGGATTTTTGG-3′，以5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3為下游引物，采用半巢式聚合酶鏈式反應連接的限制性片段長度多態(tài)性分析方法對患者樣本的基因進行突變分型。

1.3 觀察指標

1.3.1 不同預后風險患者的基礎資料比較：分別對預后良好組患者、中度風險組患者、不良風險組患者的性別、臨床類型、年齡、血脂情況、糖尿病、高血壓患病情況進行比較。

1.3.2 不同預后組患者基因突變情況分析：分別對預后良好組患者、中度風險組患者、不良風險組患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變的差異分析。

1.3.3 不同生存期患者的基因突變情況分析：分別對患者開展5年的生存分析，比較生存患者與死亡患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變的差異。

1.3.4 患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變與生存情況、預后風險之間的相關性分析：采用spearman相關性分析，對患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變與生存情況、預后風險之間的相關性分析。

2 結果

2.1 不同預后風險患者的基礎資料比較：分別對不同預后組患者的基礎資料進行比較，不同預后組患者的性別、年齡、疾病類型、BMI、慢性病患病情況之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同預后風險患者的基礎資料比較

2.2 不同預后組患者基因突變情況分析：隨著不良預后風險的增高，患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變率顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不良預后組患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變類型主要表現(xiàn)為TT、AT以及GG基因的突變，見表2。

表2 不同預后組患者基因突變的分布[n(%)]

2.3 不同生存期患者的基因突變率分析：通過對患者的5年的生存分析，生存患者90例，死亡患者30例，通過對患者不同生存期患者的基因突變情況分析，死亡組患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變率顯著高于生存組(P<0.05)。而在患者的基因突變型的分析中，死亡組患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變主要表現(xiàn)為TT基因型的突變，見表3。

表3 不同生存期患者的基因突變分布[n(%)]

2.4 DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變與生存情況、預后風險之間的相關性：患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變與生存情況、預后風險呈現(xiàn)正相關(P<0.05)，見表4。

表4 DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變與生存情況、預后風險之間的相關性分析

3 討論

骨髓增殖性腫瘤是患者的造血干細胞在分化過程中的異常增殖，造成患者的異質性基因突變性疾病。隨著患者的疾病惡化，患者可能逐步發(fā)展為骨髓纖維化，最終導致白血病的發(fā)生[6]。有流行病學調查顯示[7]，骨髓增殖性腫瘤疾病的生存情況不一，可在數(shù)月到20年之間。骨髓增殖性腫瘤疾病的發(fā)病機制以及預后的評價因素分析，有研究報道指出[8]，患者的疾病類型、年齡、細胞遺傳學以及核酸物質的差異均可導致患者的生存以及預后的差異。目前對于骨髓增殖性腫瘤患者的基因突變診斷已經(jīng)成為疾病診斷的特異性指標之一，同時也是作為臨床靶向治療的研究重點。近年來隨著基因測序手段的不斷發(fā)展，骨髓增殖性腫瘤患者的發(fā)病基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)越來越多的相關性[9]。眾多研究指出[10-11]，基因的突變不僅是骨髓增殖性腫瘤的疾病進展的標志，同時也可作為患者的不同預后的重要指標。

本研究中，通過對患者的預后以及生存情況的分析顯示，在不同預后組及不同生存期組患者中，DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變的發(fā)生率有顯著差異，隨著預后不良風險升高，患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變的發(fā)生率有顯著增加，死亡組患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變率顯著高于生存組，DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變率與生存情況、預后風險呈現(xiàn)正相關。分析認為，DNMT3A基因與DNA的甲基化顯著相關，對于腫瘤相關基因的調節(jié)以及轉錄具有顯著的沉默作用。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)[12]，單一的DNMT3A基因突變并不會造成患者的疾病進展，但是也有研究發(fā)現(xiàn)[13]，患者的DNMT3A基因突變不屬于單一事件的發(fā)生，往往與影響患者疾病進展的多種基因的突變相互影響，進而造成疾病的進展。JAK2是造成骨髓增殖性腫瘤患者進展的關鍵性因素，是JAK家族的重要成員之一，而JAK家族是對腫瘤細胞轉錄具有指導性作用。通過JAK-STAT途徑對患者的細胞表面多種受體，特別是細胞因子的信號通路受體的調控，對腫瘤細胞的增殖以及分化進行調節(jié)，而JAK2 exon12基因作為JAK2基因的亞型，同樣對患者的腫瘤細胞的增殖分化具有重要的調控作用。隨著該基因的失控、變異，患者的腫瘤細胞的調節(jié)受到嚴重干擾，腫瘤細胞呈現(xiàn)無序生長，進而表現(xiàn)為腫瘤疾病的進展以及生存期的縮短。而MPL W515基因的突變已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為骨髓增殖性腫瘤的特異性診斷依據(jù)，該基因的突變主要是通過對患者的MPL/TPOR跨膜運動中的色氨酸進行改變，將其替換為亮氨酸或賴氨酸，進而導致突變的細胞對于細胞因子的依賴性降低，進而發(fā)生異常增殖現(xiàn)象，同時有研究報道指出[14]，其對于JAK-STAT途徑的轉導具有顯著的激活作用，進而刺激疾病的進展，所以從分子生物學的分析顯示，三種基因的突變并不是相互獨立，而是相互影響，進而促使患者的疾病進展。張葉華等[15]通過對骨髓增殖性腫瘤患者的DNMT3A基因突變與疾病的預后分析顯示，隨著患者DNMT3A基因突變率的升高，患者的不良預后風險顯著升高。何志鵬等[16]通過對患者的JAK2 exon12基因突變與骨髓增殖性腫瘤發(fā)展為白血病的風險研究，患者的白血病轉化率與患者的JAK2 exon12基因突變情況呈現(xiàn)正相關。王怡斐等[17]通過對患者的骨髓增殖性細胞的MPL W515基因的突變與疾病的診斷分析顯示，患者的該基因突變發(fā)生率與患者的危險分層相關，與本研究相互印證。

綜上所述，骨髓增殖性腫瘤患者DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變可能與患者的預后相關，未來可作為患者診斷與治療的重要靶點。