董曉玉,馬晴晴，殷 俊，李家斌，鄭美娟1,,沈繼龍1,

膿毒癥在住院患者中的高患病率及在重癥監(jiān)護(hù)室的高死亡率[1]，使其成為全世界健康問(wèn)題的主要威脅。膿毒癥是宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)，引發(fā)危及生命的器官功能障礙[2]。膿毒癥早期，發(fā)熱往往是感染的唯一指標(biāo)。這些患者在發(fā)熱時(shí)常檢測(cè)白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計(jì)數(shù)和分類、超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)和降鈣素原(procalcitonin，PCT)等，來(lái)輔助判斷感染。近年來(lái)，很多學(xué)者提出“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的概念，當(dāng)機(jī)體感染微生物后可迅速誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、干擾素(interferon-gamma，IFN)-γ、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17等[3]，這種細(xì)胞因子風(fēng)暴可引起多器官的功能衰竭。該研究利用流式細(xì)胞微球陣列術(shù)(cytometric bead array，CBA)可快速、便捷地檢測(cè)細(xì)胞因子，包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α，觀察其在膿毒癥不同感染分期中的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2018年1月～2019年6月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院住院的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)患者95例，年齡33～97(64.61±18.59)歲。有以下2項(xiàng)以上者為SIRS納入標(biāo)準(zhǔn)：① 體溫>38 ℃或<36 ℃； ② 心率>90次/min；③ 呼吸>20次/min或二氧化碳分壓<4.25 kPa；④WBC計(jì)數(shù)>12×109/L， 或 <4×109/L，或幼稚中性粒細(xì)胞數(shù)>10%。排除并發(fā)嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病、晚期惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病及年齡<18歲的患者。根據(jù)膿毒癥3.0版標(biāo)準(zhǔn)[4]，患者在SIRS基礎(chǔ)上其序貫性器官功能衰竭評(píng)估(sequential organ failure assessment，SOFA)≥2分，診斷為膿毒癥。當(dāng)膿毒癥出現(xiàn)無(wú)法糾正的低血壓且患者血清乳酸水平>2 mmol/L，即可診為膿毒癥休克。據(jù)此95例SIRS患者分為非膿毒癥患者19例，膿毒癥患者56例，膿毒癥休克患者20例。另外局部感染組26例(主要是肺部及其它部位感染)，年齡29～76(61.15±19.29)歲；對(duì)照組20例(健康體檢者)，年齡26～65(45.25±12.03)歲。各組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。入選對(duì)象或家屬均簽署知情同意書。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：201801-kyxm-01)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器FACS Calibur流式細(xì)胞儀，分析軟件為Flowjo7.6，試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司CBA試劑盒，檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α水平；VIDAS電化學(xué)發(fā)光分析儀，定標(biāo)品、質(zhì)控品和試劑均為VIDAS原裝配套試劑盒，檢測(cè)PCT水平；日立7600全自動(dòng)生化分析儀，試劑、定標(biāo)品和質(zhì)控品均為利德曼配套試劑盒，檢測(cè)hs-CRP水平；Sysmex2100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，質(zhì)控品和試劑均為Sysmex原裝試劑，進(jìn)行WBC計(jì)數(shù)和分類；CD62L、CD64和CD11b檢測(cè) FACSCalibur流式細(xì)胞儀，分析軟件為Flowjo7.6；試劑為PE-CD64、FITC-CD62L、PE-CD11b、PerCP-CD45及其同型對(duì)照，紅細(xì)胞裂解液均購(gòu)自美國(guó)BD公司。檢測(cè)各分子的平均熒光強(qiáng)度(median fluorescence intensity，MFI)，同時(shí)計(jì)算外周血中性粒細(xì)胞(peripheral blood neutrophils，PBNs)表面簇分化抗原(cluster of differentiation，CD)62L指數(shù)(即中性粒細(xì)胞CD62L MFI /淋巴細(xì)胞CD62L MFI)，CD11b 指數(shù)和CD64 指數(shù)均做相同計(jì)算處理。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)本采集 患者出現(xiàn)發(fā)熱24 h內(nèi)靜脈血2 ml乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝用于WBC計(jì)數(shù)和PBNs CD64、CD11b、CD62L分子檢測(cè)；1 ml 枸櫞酸鈉抗凝血用于中性粒細(xì)胞吞噬功能實(shí)驗(yàn)；3 ml肝素抗凝血離心(4 000 r/min，5 min)后取血清-80 ℃凍存以備檢測(cè)PCT、hs-CRP、細(xì)胞因子。

1.3.2中性粒細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn) 取1 ml枸櫞酸鈉抗凝血，加入3～5滴金黃色葡萄球菌懸液(2.0麥?zhǔn)蠞舛?，混勻，置37 ℃水浴箱中，孵育30 min，每10 min搖勻1次。制備血涂片并瑞吉氏染色，計(jì)算吞噬了金黃色葡萄球菌的中性粒細(xì)胞吞噬百分率(吞噬細(xì)菌的中性粒細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的中性粒細(xì)胞總數(shù))、吞噬指數(shù)(計(jì)數(shù)的中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌總數(shù)/計(jì)數(shù)的中性粒細(xì)胞總數(shù))。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與局部感染組、SIRS組患者細(xì)胞因子的水平對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組以及各實(shí)驗(yàn)組之間比較，細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1A、1B、1E、1F。細(xì)胞因子IL-6在三組患者中的水平依次為SIRS組>局部感染組>對(duì)照組(F=21.696，P<0.01)，見圖1C；細(xì)胞因子IL-10在三組患者中的水平依次為SIRS組>局部感染組>對(duì)照組(F=23.328，P<0.01)，見圖1D。IL-6、IL-10是反映SIRS的有效指標(biāo)。

2.2 非膿毒癥組、膿毒癥組、膿毒癥休克組患者血清IL-6、IL-10水平的比較及診斷效能分析觀察血清IL-6和IL-10水平在膿毒癥診斷和分期中的價(jià)值，血清IL-6在三組患者中的水平依次為膿毒癥休克組>膿毒癥組>非膿毒癥組(F=46.892，P<0.01)，見圖2A。膿毒癥休克組和膿毒癥組患者血清IL-10水平高于非膿毒癥組(F=13.077，P<0.01)，而膿毒癥休克組與膿毒癥組之間患者血清IL-10水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2B。利用ROC曲線分析血清IL-6、IL-10水平在膿毒癥休克的診斷價(jià)值，見圖2C、表1，血清IL-6在膿毒癥休克的診斷效能大于IL-10。

2.3 IL-6水平高低兩組膿毒癥患者各其余炎性指標(biāo)的比較依據(jù)膿毒癥休克IL-6最佳截?cái)嘀?95.46 pg/ml, 將膿毒癥和膿毒癥休克患者分為高IL-6組和低IL-6組，比較兩組患者其余炎性指標(biāo)。高IL-6組患者血清hs-CRP、PCT、IL-6、IL-10水平均高于低IL-6組(P<0.01)，而兩組之間WBC計(jì)數(shù)、PBNs計(jì)數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。高IL-6組患者同時(shí)高表達(dá)炎性標(biāo)志物。

表1 IL-6和IL-10在膿毒癥休克中的診斷效能分析

2.4 IL-6水平高低兩組膿毒癥患者中性粒細(xì)胞表型的表達(dá)檢測(cè)IL-6水平高低兩組膿毒癥患者PBNs表面CD62L、CD64和CD11b分子，其MFI的表達(dá)，結(jié)果見圖3A、B、C。低IL-6組和高IL-6組PBNs CD62L指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3D。高IL-6組PBNs CD64 指數(shù)高于低IL-6組(t=3.189，P<0.01)，PBNs CD11b 指數(shù)高于低IL-6組(t=2.711，P<0.01)，見圖3E、3F。

2.5 IL-6水平高低兩組膿毒癥患者中性粒細(xì)胞吞噬功能的比較比較IL-6水平高低兩組膿毒癥患者中性粒細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌功能，高IL-6組膿毒癥患者的中性粒細(xì)胞吞噬百分率高于低IL-6組(t=4.311，P<0.01)，吞噬指數(shù)亦高于低IL-6組(t=3.067，P<0.01)，見圖4。高IL-6組膿毒癥患者中性粒細(xì)胞的吞噬功能更為活躍。

圖1 對(duì)照組、局部感染組與SIRS組的細(xì)胞因子水平的比較

圖2 非膿毒癥組、膿毒癥組、膿毒癥休克組血清IL-6和IL-10水平的比較及診斷效能分析

表2 低IL-6組和高IL-6組患者各檢測(cè)指標(biāo)的比較

圖3 IL-6水平高低兩組膿毒癥患者PBNs CD64、CD11b、CD62L平均熒光強(qiáng)度的表達(dá)及指數(shù)的比較

3 討論

膿毒癥是由細(xì)菌感染引起SIRS的持續(xù)發(fā)展、不斷惡化的動(dòng)態(tài)過(guò)程。其病理生理過(guò)程中，細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是主要誘因。LPS可激活免疫細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子，旨在清除病原菌。而細(xì)胞因子的過(guò)度釋放會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，影響病程和預(yù)后。

本研究顯示，血清IL-6和IL-10水平：膿毒癥組>SIRS組>局部感染組，IL-6和IL-10可作為膿毒癥診斷的良好指標(biāo)。IL-6是細(xì)胞因子風(fēng)暴的核心成員，一般細(xì)菌感染1 h后血液IL-6水平迅速升高，2 h 即達(dá)到高峰。機(jī)體感染時(shí)，血清IL-6水平迅速升高，IL-6是參與SIRS、膿毒癥及并發(fā)多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的重要細(xì)胞因子[5]。許多研究[6-7]表明，血清IL-6水平對(duì)膿毒癥早期診斷具有很高的敏感性和特異性。膿毒癥患者在炎癥介質(zhì)大量釋放的同時(shí)，亦伴隨體內(nèi)抗炎因子的釋放，而IL-10是輔助性Th2(T-helpercell 2)細(xì)胞等分泌的強(qiáng)效抗炎因子，可抑制IL-1、IL-6、IL-8以及TNF-α等因子的釋放。有研究[8]表明血清IL-10水平隨著膿毒癥患者IL-6水平升高而調(diào)控性的升高，且IL-6和IL-10與膿毒癥患者的病情和預(yù)后相關(guān)[9]。本研究中，膿毒癥時(shí)血清IL-6、IL-10水平升高，高達(dá)正常值的數(shù)百、數(shù)千倍。Sapan et al[10]報(bào)道，膿毒癥患者并發(fā)MODS時(shí)，血清IL-6和IL-10水平會(huì)進(jìn)一步升高。本研究顯示膿毒癥休克患者血清IL-6水平高于膿毒癥組，而兩組間血清IL-10水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)膿毒癥休克的ROC效能分析，顯示IL-6曲線下面積、靈敏度、特異度分別為0.882、85.00%、80.40%，均高于IL-10，這與Jekarl et al[11]報(bào)道的結(jié)果相似?？梢姡噍^于IL-10，血清IL-6水平對(duì)于膿毒癥的診斷和分期更具價(jià)值，這可能與IL-6的過(guò)量表達(dá)造成組織器官的損傷及功能障礙有關(guān)。以IL-6最佳截?cái)嘀?95.46 pg/ml，將膿毒癥及膿毒癥休克患者分為高IL-6 組和低IL-6 組，結(jié)果顯示高IL-6組血清hs-CRP、PCT、IL-6、IL-10水平均高于低IL-6組?？梢姼逫L-6組膿毒癥患者的其它炎性指標(biāo)同時(shí)升高；而外周血WBC計(jì)數(shù)、PBNs計(jì)數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與重癥感染時(shí)，WBC有時(shí)會(huì)左移相關(guān)。感染時(shí)除了細(xì)胞因子的作用，占外周血白細(xì)胞總數(shù)50%～70%的PBNs，其活化、吞噬、殺菌的固有免疫功能亦發(fā)揮強(qiáng)大作用。病原體感染后，CD64、CD11b和CD62L等黏附或趨化因子表達(dá)上調(diào)，激活PBNs。Aydinl et al[12]曾報(bào)道，膿毒癥時(shí)PBNs CD11b、CD64分子高表達(dá)，而CD62L未見明顯升高，本研究結(jié)果與之相似。一份Meta分析[13]顯示PBNs CD11b可作為新生兒膿毒癥的早期診斷指標(biāo)，且與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。有報(bào)道[14]CD64指數(shù)聯(lián)合IL-6檢測(cè)能提高血液科發(fā)熱患者血培養(yǎng)陽(yáng)性的靈敏度。本研究比較了PBNs CD62L指數(shù)、CD64指數(shù)、CD11b指數(shù)，而不單純使用這些分子的MFI或陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)百分比，是為了減少陰性對(duì)照的淋巴細(xì)胞和人為因素的誤差。比較顯示高IL-6組PBNs CD11b和CD64表達(dá)均高于低IL-6組，同時(shí)高IL-6組膿毒癥患者中性粒細(xì)胞吞噬功能高于低IL-6組。這可能與炎癥持續(xù)，中性粒細(xì)胞仍處于免疫活化狀態(tài)相關(guān)，此結(jié)果與高IL-6組患者伴隨PBNs CD64、CD11b高表達(dá)相一致。

圖4 IL-6水平高低兩組膿毒癥患者中性粒細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的比較

綜上所述，膿毒癥患者血清IL-6和IL-10水平顯著提高，膿毒癥休克患者血清IL-6水平進(jìn)一步升高，高IL-6水平同時(shí)伴有中性粒細(xì)胞的免疫活性增強(qiáng)，中性粒細(xì)胞高表達(dá)CD64、CD11b分子及高吞噬力。血清IL-6是膿毒癥診斷和分期的有效指標(biāo)。膿毒癥時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清IL-6水平可為膿毒癥臨床診斷、疾病進(jìn)展提供依據(jù)，值得在臨床推廣。