許 露，郭 嘉，吳海波，高 敏，徐方舟，張妍蓓

在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者中，最為重要的分子靶向基因是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)[1]。目前常用的基因突變檢測方法: 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)、Sanger測序法、下一代測序技術(shù)(next-generation sequencing technology, NGS)等，因受限于標(biāo)本的來源、檢測技術(shù)要求高及費用昂貴等因素的影響，目前難以普及開展。特異性血漿腫瘤標(biāo)志物對惡性腫瘤患者的診斷具有重要作用，且取材方便、檢測速度快、患者配合度高，更加適用于肺癌突變基因的早期篩檢。熱休克蛋白90(heat shock proteins90, HSP90)是一種新發(fā)現(xiàn)的具有分子伴侶功能，腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP) 依賴的，高度保守的蛋白質(zhì)，其在細(xì)胞內(nèi)與多種細(xì)胞周期信號通路中的關(guān)鍵蛋白酶相互作用，調(diào)控細(xì)胞的生存、分化及代謝等重要生理過程[2]。有研究表明，肺癌及其他實體腫瘤患者的血漿HSP90α表達(dá)水平顯著高于健康人群。說明血液HSP90α在肺癌的早期篩檢中有一定作用[3]。

目前尚無血漿HSP90α聯(lián)合臨床特征預(yù)測NSCLC患者EGFR基因突變的研究，因此，該文回顧性研究患者治療前HSP90α濃度聯(lián)合性別、腫瘤分期及轉(zhuǎn)移的接受者操作特性曲線 (receiver operating characteristic curve, ROC)，旨在探索四者聯(lián)合對NSCLC患者EGFR基因突變的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1 病例資料收集89例于2016年3月14日～2019年10月1日就診于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行經(jīng)支氣管鏡肺活檢術(shù)(transbronchial lung biopsy, TBLB)或CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺肺活檢術(shù)(percutaneous aspiration lung biopsy, PALB)進(jìn)行病理學(xué)確診并行基因檢測的NSCLC患者。其中男性50例，女性39例，年齡為30～89(64.12±11.084)歲；腺癌71例，鱗癌10例，未分類8例；臨床分期為 I～ⅢA期14例，ⅢB～Ⅳ期75例；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為66例，23例無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；患者中39例有EGFR突變，50例無EGFR突變。所有入選患者均為首次診斷；無其他腫瘤疾病史及肝、腎等重要臟器嚴(yán)重病變，無內(nèi)分泌代謝紊亂史。

1.2 HSP90α濃度測定患者均在入院第2天空腹使用EDTA抗凝管采集靜脈血2 ml，于4 ℃, 3 000 r/min, 離心10 min，分離血漿，并于- 80 ℃ 凍存。所有標(biāo)本統(tǒng)一解凍后，應(yīng)用ELISA檢測血漿HSP90α濃度，具體檢測方法嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。其定量檢測試劑盒、酶免分析儀均由煙臺普羅吉生物科技發(fā)展有限公司提供。HSP90α正常參考值范圍為：0～82.06 ng/ml。

1.3 EGFR基因檢測血液/組織基因組按照DNA提取試劑盒提取，由天根生化科技(北京)有限公司提供。利用天津諾禾致源生物科技有限公司提供的實體瘤靶向用藥基因建庫試劑盒(僅供科研使用)構(gòu)建文庫。使用美國Illumina公司的測序高通量測序上機測序試劑盒對多位點文庫進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征與EGFR基因突變的分析將患者的不同臨床病理特征分組，進(jìn)而比較EGFR基因檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)， EGFR突變率與患者的性別、腫瘤轉(zhuǎn)移及分期均有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 EGFR突變與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 HSP90α與EGFR突變的關(guān)系分析將HSP90α表達(dá)水平與正常參考值范圍比較，分為正常組及異常組，分析兩組HSP90α不同表達(dá)水平與EGFR基因的關(guān)系。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)EGFR突變與HSP90α的水平升高有關(guān)。詳見表2。

表2 EGFR與HSP90α 異常表達(dá)水平的關(guān)系[n(%)]

按不同HSP90α濃度梯度分組進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示不同濃度的HSP90α與EGFR突變有統(tǒng)計學(xué)意義，且HSP90α表達(dá)水平越高，EGFR基因突變率越高。詳見表3。

表3 不同HSP90α濃度與EGFR檢測結(jié)果的比較[n(%)]

2.3 HSP90α聯(lián)合臨床特征預(yù)測EGFR突變采用ROC 曲線分析比較89例NSCLC患者的HSP90α濃度及性別、臨床分期及轉(zhuǎn)移單獨或聯(lián)合診斷EGFR 突變的效能。見圖1。

圖1 血清中HSP90α及臨床特征單一或聯(lián)合對EGFR突變診斷的ROC曲線

HSP90α濃度及性別、臨床分期及轉(zhuǎn)移聯(lián)合診斷的ROC曲線AUC為0.848，在臨界值時的敏感度為0.795，特異度為0.740。可見HSP90α濃度及性別、臨床分期及轉(zhuǎn)移四項聯(lián)合檢測可以提高EGFR突變診斷的效能。見表4。

2.4 HSP90α水平與各臨床特征之間的關(guān)系比較不同臨床特征的患者HSP90α表達(dá)水平的差異，結(jié)果顯示僅患者是否轉(zhuǎn)移組別間HSP90α的表達(dá)水平存在差異，有轉(zhuǎn)移者HSP90α表達(dá)水平異常率較高，其他不同臨床特征的患者HSP90α表達(dá)水平無差異。詳見表5。

表4 臨床特征與血漿HSP90α濃度對EGFR突變的診斷價值比較

表5 臨床特征與血漿HSP90α濃度表達(dá)水平差異的比較[n(%)]

3 討論

隨著基因檢測手段的發(fā)展和精準(zhǔn)醫(yī)療概念的推廣，肺癌的治療模式已轉(zhuǎn)向靶向特定信號通路中的相關(guān)異常分子。EGFR是一種分布于上皮細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，由胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)合區(qū)組成。據(jù)統(tǒng)計[4], EGFR基因敏感突變在晚期NSCLC患者中的發(fā)生率約為10%～20%。近年來，針對EGFR基因的治療在臨床取得了顯著的療效，比傳統(tǒng)的化療方案更能夠顯著延長患者的中位生存期，引領(lǐng)了肺癌靶向治療的前行步伐。有研究[5]表明，EGFR基因突變在亞洲、女性、不吸煙及腺癌的患者中發(fā)生率更高，EGFR基因突變患者相對更易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，最常見的是骨轉(zhuǎn)移與腦轉(zhuǎn)移[6]，亦說明腫瘤分期越晚EGFR基因突變的機率越大。本研究數(shù)據(jù)表明EGFR基因突變率在女性、ⅢB～Ⅳ期、轉(zhuǎn)移的患者(58.97%、49.33%和54.55%)高于男性、I～ⅢA期患者、無轉(zhuǎn)移患者(32.00%、14.29%和13.04%，P<0.05)，與以往研究結(jié)果一致。

HSP90是一類分子質(zhì)量約為90 ku的同二聚體蛋白，在NSCLC患者中高表達(dá)，其升高與年齡、既往吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[7]，可以預(yù)測患者的預(yù)后。HSP90α是 HSP90 亞型中唯一可以在血漿中被檢測到的。我們的研究顯示HSP90α高表達(dá)與NSCLC患者發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.027)，已有的研究[8-9]表明在胃癌、肝癌、乳腺癌患者中，將無轉(zhuǎn)移灶患者和發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的血漿HSP90α水平進(jìn)行比較，在發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者中血漿HSP90α明顯增高。

已知HSP90α的底物蛋白有200多種，其中包括EGFR、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER-2)、血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)等，在細(xì)胞中充當(dāng)細(xì)胞因子，參與細(xì)胞的各種生命活動[10]。HSP90α在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到了維持EGFR功能穩(wěn)定的作用，在多種腫瘤組織中表達(dá)增高，參與腫瘤進(jìn)展的許多關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。在本研究中，當(dāng)HSP90α表達(dá)水平異常升高(HSP90α>82.06 ng/ml提示異常)情況下，患者EGFR突變風(fēng)險高于正常值(P=0.025)，說明HSP90α升高與EGFR的突變正相關(guān)。本研究數(shù)據(jù)分析還發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的升高，EGFR基因突變率呈上升趨勢(P=0.007)。

有研究[12]顯示檢測HSP90α有助于評估NSCLC患者化療療效并指導(dǎo)治療。亦有研究[13]證實HSP90抑制劑與EGFR-TKI聯(lián)合使用，可使抑制肺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用加強。故HSP90α高水平表達(dá)與EGFR突變之間存在關(guān)聯(lián)。因基因檢測操作技術(shù)有創(chuàng)且費用昂貴，在我國基因檢測率尚不高。 因此，研究HSP90α及臨床特征來預(yù)測EGFR基因突變也是有意義。本研究分析，發(fā)現(xiàn)HSP90α對于預(yù)測EGFR基因突變的敏感度尚可，但特異度欠佳，可能與HSP90α異常高水平表達(dá)時，才與EGFR突變正相關(guān)，同時本研究的病例中HSP90α異常比例相對較低，不排除存在選擇偏移的影響。如果綜合性別、腫瘤分期、轉(zhuǎn)移和HSP90α來預(yù)測EGFR基因突變情況，可見敏感度提高(79.5%)(P<0.001)，這說明綜合臨床特征預(yù)測EGFR基因突變中血漿HSP90α起很重要的作用。

臨床中患者為女性，分期為ⅢB～Ⅳ期，有局部轉(zhuǎn)移，且HSP90α超過82.06 ng/ml，根據(jù)研究的預(yù)測模型，可指導(dǎo)疑似突變患者進(jìn)一步行病理檢測確診，對于難行病理活檢的患者可考慮應(yīng)用靶向治療。因EGFR基因突變檢測也存在異質(zhì)性,部分檢測陰性的患者,也能從靶向治療中獲益。因此，如果符合該預(yù)測模型中的各個因素，考慮EGFR突變可能性較大，可指導(dǎo)進(jìn)一步確診或靶向治療。