丹歸膠囊對大鼠卵巢儲備功能低下的改善作用及機(jī)制研究*

楊真兒,劉 玲,張靜文,武 婧,金建文，王 川,3,史永恒,3,Waqas Khan(巴基斯坦),劉繼平△

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(咸陽 712046)；2.陜西麗彩藥業(yè)有限公司(咸陽 712046)；3.陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)研究室(咸陽 712046)

在女性生殖系統(tǒng)中，卵巢主要功能是規(guī)律性地生成卵泡并在卵泡成熟后排出，以及分泌雌激素和孕激素[1]，維持女性的月經(jīng)和生殖功能。卵巢儲備功能的高低，主要是看卵巢儲備的卵泡數(shù)量的多少以及質(zhì)量的好壞，這兩項(xiàng)指標(biāo)也側(cè)面表達(dá)了女性生育功能的潛能[2]。目前西醫(yī)針對卵巢儲備功能低下(Decreasing ovarian reservation,DOR)的治療方法主要是激素治療，多以雌激素類藥戊酸雌二醇配避孕藥黃體酮建立人工周期[3]，用來增補(bǔ)與 DOR 相關(guān)的激素缺乏，輔以誘導(dǎo)排卵、免疫抑制劑治療等[4]，是針對患者水平下降的激素進(jìn)行相對的補(bǔ)充。卵巢儲備功能下降在中醫(yī)上可歸為 “血枯”“經(jīng)水早斷”“閉經(jīng)”等疾病范疇[5]?！渡蚴吓戚嬕ぴ率虏粊怼罚骸啊督饏T》言婦人經(jīng)水不來之化，分三大綱；積冷，氣結(jié)兩者，皆血滯不行，于法宜通，冷者溫經(jīng)行血。”張仲景認(rèn)為閉經(jīng)之病因是“陰虛、積冷、結(jié)氣”。女性的月經(jīng)、生殖與氣血、脾腎功能緊密相連，治療也圍繞健脾益氣、滋陰養(yǎng)血展開。

丹歸膠囊由黨參、黃芪、當(dāng)歸、枸杞子、丹參5味中藥組成，具有益氣補(bǔ)血、祛斑調(diào)經(jīng)的作用，用于氣血兩虧所致的月經(jīng)后期，黃褐斑或月經(jīng)后期伴黃褐斑；可見月經(jīng)色淡質(zhì)稀、神疲乏力、少氣懶言、面色蒼白、頭暈眼花、舌質(zhì)淡胖或有齒印、脈細(xì)無力。本課題組采用環(huán)磷酰胺制備大鼠卵巢儲備功能低下模型，評估丹歸膠囊的改善作用并探討其機(jī)制。

材料與方法

1 動物模型 體重約220～250 g的12周齡健康SPF級別SD雌性大鼠48只，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2015-030。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，動物分籠飼養(yǎng)，光照周期設(shè)置成12 h，自由進(jìn)食、飲水。分組：健康SD雌性大鼠48只，有正常的動情周期，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為六組：空白組、環(huán)磷酰胺組(模型組)，丹歸膠囊低、中、高劑量組(0.2、0.4、0.8 g/kg)，坤泰膠囊組(0.6 g/kg)，每組8只。除空白組外的其余五組，均腹腔注射環(huán)磷酰胺1次，劑量為75 mg/kg(14 d成模)[6]，空白組給予等體積的生理鹽水。在造模的同時(shí)，給予坤泰膠囊和高、中、低劑量的丹歸膠囊，連續(xù)灌胃36 d。

2 藥物試劑與主要儀器 丹歸膠囊(國藥準(zhǔn)字 Z20040084,0.3 g/粒，3粒/次，2次/d)：取出膠囊內(nèi)粉劑，用蒸餾水配成濃度為 0.15 g/ml 的溶液待用；坤泰膠囊(國藥準(zhǔn)字 Z20000083，0.5 g/粒，4粒/次，3次/d)：用蒸餾水將囊內(nèi)藥粉配成0.25 g/ml 濃度的溶液待用。注射用環(huán)磷酰胺(200 mg/支，國藥準(zhǔn)字:H32020857)，用 0.9 %生理鹽水配成濃度為 20 mg/ml 待用。

卵泡刺激素(雅培，批號：88473UI01)，雌二醇(雅培，批號：95176UI00)，促黃體生成素(雅培，批號：93241UI01)，AMH(抗穆勒試管激素)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒(艾萊薩生物科技上海有限公司，批號：EIA-3083)； GDF-9(Affbiotech公司，貨號：DF7069)，Egr-1(WanleibioHRP 公司，貨號：WL00344 )，標(biāo)記山羊抗兔IgG(ThermoFisher公司，貨號：#31460)，蘇木精(Solarbio公司，貨號：H8070)，山羊血清(Solarbio公司，貨號：SL038)，PBS 緩沖液(HyClone公司，貨號：SH30256.01B)，蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin-eosin HE)試劑盒(Wanleibio公司，貨號： WLA051a)。

化學(xué)發(fā)光儀(雅培，i4000SR)，全自動酶標(biāo)儀(UR1T-660)，BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)，水平搖床(北京六一公司)，雙垂直蛋白電泳儀(北京六一公司)，凝膠成像系統(tǒng)(北京六一公司)，顯微鏡(BX53，OLUMPUS公司),石蠟切片機(jī)(RM2235,Leica德國)，熒光定量 PCR 儀(Exicycler 96，BIONEER公司)，顯微鏡拍照系統(tǒng)(DP73，OLUMPUS公司)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 大鼠行為學(xué)、動情周期變化：記錄大鼠的活動量、進(jìn)食量及進(jìn)水量、體重等數(shù)據(jù)。在第5～14天和第27～36天期間，每日用一次性醫(yī)用棉簽蘸取濃度4%的磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer saline,PBS)，插入大鼠陰道內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)取大鼠陰道分泌物，涂抹于載玻片上，HE 染色，記錄組別及編號，樹脂封片，靜置陰涼通風(fēng)處干燥后于光鏡下觀察大鼠陰道上皮細(xì)胞的變化。

3.2 檢測大鼠激素水平變化:采用ELISA 法檢測性激素AMH水平，酶聯(lián)免疫法檢測性激素FSH、LH、E2水平。

3.3 卵巢、子宮組織的質(zhì)量測定及卵巢組織形態(tài)學(xué)變化:用精密電子天平將解剖取出的雌性大鼠的卵巢及子宮分別進(jìn)行稱重并記錄數(shù)據(jù)。用配制的4 %多聚甲醛固定液固定半數(shù)卵巢組織(其余用作PCR檢測)。進(jìn)行乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片機(jī)切片 2 μm，脫蠟后 HE 染色，樹膠封片，晾干后于光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。

3.4 免疫組化法測大鼠卵巢GDF-9(生長分化因子-9)、Egr-1(早期生長反應(yīng)因子-1)蛋白表達(dá):將固定好的組織流水沖4 h后乙醇梯度脫水：70 %(2 h)、80 %(過夜)、90 %(1 h)、95 %(1 h)、100 %Ⅰ(20 min)、100 %Ⅱ(20 min)。放入二甲苯中至標(biāo)本透明(30 min)。透蠟、包埋，切片5 μm于溫水皿中展開，移到載玻片上，60 ℃烘箱烘2 h，脫蠟至水。抗原修復(fù)，3 % 過氧化氫孵育，山羊血清封閉。用PBS稀釋一抗完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)4 ℃ 過夜，取出后浸泡PBS 5 min，重復(fù)3次。HRP標(biāo)記二抗用PBS稀釋500倍完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)37 ℃ 孵育60 min，浸泡 PBS 5 min，重復(fù)3次。等量混合DAB顯色試劑A、B，切片滴加100 μl顯色試劑，觀察顏色剛變深快速放在水中終止反應(yīng)。 HE 復(fù)染，脫水、透明、封片，鏡檢?？贵w稀釋比例見表1。

表1 卵巢組織相關(guān)蛋白抗體和稀釋比例

3.5 采用Real Time PCR法檢測大鼠卵巢中TNF-α mRNA、INF-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化情況:向樣本中加入1 ml TRIpure 裂解液，充分混勻，室溫下靜置5 min；向上述溶液中加入200 μl氯仿，上下顛倒混勻，室溫下靜置3 min；4 ℃ 10000 g離心10 min，樣品分成3層：黃色的有機(jī)相，中間層和無色的水相，將其中的水相移到新的離心管中；加入異丙醇(與水相等體積)顛倒混合均勻，-20 ℃條件下過夜；15 h 后，4 ℃10000 g離心10 min，棄上清；加入1 ml 75 %乙醇，4 ℃3400 g離心3 min，棄上清；室溫下靜置 5～6 min，讓殘余的乙醇揮發(fā)；加30 μl RNase-free ddH2O，室溫放置2 min，充分混勻，待其沉淀完全溶解，所得到的即為樣本的總 RNA。使用紫外分光光度計(jì)NANO 2000 檢測各樣本中RNA的濃度。利用 PCR 儀將得到的 RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，最后得到20 μl cDNA樣本。反應(yīng)體系：cDNA模板1 μl；上下游引物(10 μmol/L) 各0.5 μl；SYBR GREEN mastermix 10 μl；用ddH2O補(bǔ)足至20 μl。Realtime PCR 反應(yīng):應(yīng)用兩步法反應(yīng)程序，預(yù)變性94 ℃ 5 min、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s；然后40個(gè)循環(huán)反應(yīng):72 ℃ 2 min 30 s、40℃ 1 min 30 s。卵巢組織細(xì)胞因子引物序列見表2。分析方法利用2-△△ CT方法。

表2 卵巢組織各細(xì)胞因子引物序列

結(jié) 果

1 大鼠行為學(xué)及動情周期變化 見表3?？瞻捉M大鼠皮毛白凈有光澤感，精力充沛，進(jìn)食飲水量正常，體重逐步增加。模型組大鼠精神狀態(tài)低迷，疲懶不愛動，皮毛干燥無光澤，喜喝水厭食，大便稀，體重較之前減輕。丹歸膠囊組和坤泰膠囊組大鼠隨著給藥天數(shù)增多，各種情況逐漸好轉(zhuǎn)，體重漸長。

表3 各組大鼠動情周期變化比較

空白組的發(fā)情周期大致為5 d，紊亂率為 0；所有模型組大鼠均出現(xiàn)延期現(xiàn)象，為9～10 d，紊亂率為100%，與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。丹歸膠囊高、低劑量組紊亂率均為 37.50%，中劑量組紊亂率為 25.00%，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 大鼠血清AMH水平和放射免疫分析法測LH、FSH、E2水平 見表4。與空白組比較，模型組大鼠血清中 FSH、LH明顯升高，E2、AMH 明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，丹歸膠囊三組大鼠血清 FSH、LH 明顯降低，E2、AMH 明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明丹歸膠囊可以降低因DOR導(dǎo)致的FSH、LH的異常升高，并促進(jìn)E2、AMH的分泌，改善內(nèi)分泌激素紊亂，以達(dá)到改善卵巢功能的目的。

表4 各組大鼠血清FSH、LH、E2、AMH含量比較

3 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化 空白組大鼠新鮮卵巢呈淡紅色且富有彈性，各級卵泡形態(tài)均可見卵泡[7](原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡)，卵泡數(shù)量較多且飽滿，血管分布廣；模型組大鼠卵巢灰白色，卵泡數(shù)相對減少，閉鎖卵泡多；丹歸膠囊低、中劑量組大鼠卵巢外觀淡粉色，卵泡數(shù)量較模型組有所增多但不及空白組，卵泡正常，可見各級形態(tài)；丹歸膠囊高劑量組大鼠卵巢外觀粉紅色，卵泡數(shù)量較正常水平少，可見各級卵泡形態(tài)(圖1)。

圖1 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化(HE 染色，×200)

4 各組大鼠GDF9、Egr-1蛋白的表達(dá) 見表5(圖2)。模型組大鼠較空白組卵巢中GDF-9、 Egr-1蛋白表達(dá)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；丹歸膠囊低、中、高劑量組大鼠卵巢中GDF-9、Egr-1蛋白表達(dá)升高，以丹歸膠囊高劑量組最明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；坤泰膠囊組較模型組大鼠卵巢中GDF-9、 Egr-1蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 各組大鼠卵巢GDF-9、Egr-1 蛋白表達(dá)比較

圖2 大鼠卵巢組織GDF-9、Egr-1蛋白的表達(dá)(SP染色，×400)

5 各組大鼠卵巢 TNF-α mRNA、INF-γ mRNA的表達(dá) 見表6。與空白組相比，模型組大鼠卵巢中TNF-α mRNA、INF-γ mRNA表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組比較，坤泰膠囊組大鼠卵巢中TNF-α mRNA、INF-γ mRNA表達(dá)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，丹歸膠囊低、中、高劑量組大鼠卵巢中TNF-α mRNA、INF-γ mRNA表達(dá)有不同程度的降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明丹歸膠囊可能是通過調(diào)控TNF-α mRNA、INF-γ mRNA的表達(dá)來達(dá)到抑制炎癥，保護(hù)卵巢組織功能的作用。

表6 各組大鼠卵巢組織TNF-α mRNA、INF-γ mRNA表達(dá)比較

討 論

卵巢儲備功能下降是指女性在四十歲前出現(xiàn)卵泡數(shù)量減少、卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，危害女性生殖健康甚至不育。但 DOR 的病因尚不明確，目前認(rèn)為可能與遺傳因素、酶缺乏、促性腺激素及其受體異常、自身免疫損傷[8]、卵巢破壞性因素(放療、化療、手術(shù)、感染等)、 抑制素異常、卵泡生成障礙、卵細(xì)胞儲備過少或耗竭過多[9]以及心理因素、社會及家庭因素、生理因素及個(gè)體差異等有關(guān)[10]。中醫(yī)理論認(rèn)為，女子以血為本，脾能統(tǒng)攝血液，因此脾為女性衰老論治之重點(diǎn)[11]。脾損傷則生化不足，氣血枯耗無力推動血行。脾氣虛久必及腎，脾腎陽虛，不能溫養(yǎng)，以致經(jīng)閉不行、宮寒。陳修園《女科要旨》中說：“雖曰，心生血，肝藏血，沖任督三脈俱為血海，為月信之源，而其統(tǒng)主則惟脾胃”。說明氣血充沛，脾胃、沖任調(diào)和，才能維系女性月經(jīng)、生殖健康[12]。而丹歸膠囊中黨參能補(bǔ)益脾胃，運(yùn)化精微，滋生陰血，有補(bǔ)氣生血之效。黃芪，歸脾、肺經(jīng)，具補(bǔ)氣升陽，補(bǔ)脾益肺，益氣生血之功。枸杞為輔藥，既能補(bǔ)肝腎之陰，又有養(yǎng)血之功[13]，藥性平和。當(dāng)歸質(zhì)潤味辛性溫，既能養(yǎng)血調(diào)經(jīng)又能活血行氣。丹參具有很好的養(yǎng)血和血的功效。因此，丹歸膠囊治療DOR具有良好的健脾益氣、補(bǔ)氣養(yǎng)血的功效。

評估卵巢功能的常用指標(biāo)是FSH、LH、E2及 AMH。主要由于卵巢除產(chǎn)生卵細(xì)胞外，還合成和分泌多種雌激素和孕激素[14]。雌激素中 E2的含量最高且活性最強(qiáng)，主要是促進(jìn)女性生殖器官正常發(fā)育并維持女性生理特征，對女性的月經(jīng)、懷孕有著巨大的影響。FSH、LH是直接作用卵巢皮層的促性腺激素，用于調(diào)節(jié)卵巢功能。卵巢功能衰退時(shí)，卵泡數(shù)量和雌激素的同時(shí)減少可徑直引發(fā) FSH 和 LH 升高，遏制卵泡和卵子的生長發(fā)育，嚴(yán)重影響卵巢功能[15]。但 FSH、 LH、 E2會隨著月經(jīng)周期而變動,而AMH任何時(shí)間的濃度都一樣穩(wěn)定。AMH指數(shù)越高，說明卵子的庫存量越大，生育能力自然就較強(qiáng)；AMH指數(shù)降低時(shí)，就代表著卵巢正在老化，即女性生育力的衰退[16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹歸膠囊能夠改善大鼠的精神不振，活動度差，皮毛無光澤等外在變化，表明丹歸膠囊可以改善卵巢儲備功能低下所導(dǎo)致的情志抑郁、形體消瘦等癥狀；丹歸膠囊可以調(diào)節(jié)卵巢儲備功能低下大鼠紊亂的內(nèi)分泌，降低其 FSH、LH 并升高E2、 AMH，提高卵巢儲備功能；丹歸膠囊能夠修復(fù) DOR 大鼠受損的卵巢組織，使成熟卵泡增多，其中以丹歸低劑量和丹歸中劑量組效果最佳；丹歸膠囊能夠降低卵巢儲備功能低下大鼠卵巢中 TNF-α mRNA、INF-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平并提高GDF-9、Egr-1蛋白的表達(dá)，改善卵巢儲備功能。

綜上所述，對女性的卵巢儲備功能下降歸于脾胃失調(diào)、氣血兩虛。丹歸膠囊能健脾益氣、補(bǔ)氣養(yǎng)血，降低性激素 FSH、LH，升高 E2及AMH的水平，降低TNF-α mRNA、INF-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平，提高GDF-9、Egr-1蛋白的表達(dá)，改善卵巢儲備功能低下患者的卵巢儲備功能。