鄭寶強，喬紅娟，李柏君，KAOTachung，張 燕，王 雁＊

(1. 國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2. Gao's Orchid Garden，AV Geroldo Azzoni 905 Rio Acima Jundiai SP，Brasil 13215-840；3. 北京市電氣工程學(xué)校，北京 100025)

許多植物中都存在綠色葉片出現(xiàn)黃色或白色斑塊的突變體[1-7]，這些突變植株是研究光合作用、葉綠素合成代謝和葉綠體發(fā)育等過程的極佳材料[8]。此外，這類表型也是許多觀賞花卉的主要觀賞性狀，是園藝工作者對花卉品種的主要改良和育種目標(biāo)之一[9-11]。因此，探究葉片黃色或白色的斑化形成機制具有重要的生物學(xué)意義和應(yīng)用價值。

葉綠素是使植物葉片顯綠色的主要色素，其在植物體內(nèi)的生物合成通路已經(jīng)得到了詳細描述和報道[12-15]。許多研究表明，葉綠素生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達量變化會直接決定葉綠素在組織中的積累量，從而影響葉片顏色的表型[16-17]。當(dāng)這些結(jié)構(gòu)基因表達量下降時，會導(dǎo)致中間產(chǎn)物無法被催化成葉綠素，最終使葉片失綠從而產(chǎn)生白色或黃色的斑塊或條紋[15,18-20]；同時，造成組織失綠的具體機制在不同植物之間存在差異。因此，探索不同植物突變體葉片失綠的具體分子機制具有重要的意義，是對相關(guān)植物進行葉色園藝性狀改良的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

蘭科(Orchidaceae)植物因其獨特的花形、豐富的花色和迷人的花香而世界聞名，其許多種和栽培品種已成為廣受大眾歡迎的觀賞花卉。葉片失綠的突變現(xiàn)象在蘭花中被稱為“葉藝”，其能夠提高蘭花的觀賞價值，是蘭花園藝工作者主要的選育目標(biāo)之一[21]。但是，目前葉藝在蘭科中的分子機制研究較少，僅在蘭屬（Cymbidium）[20,22-23]和卡特蘭屬（Cattleya）[24]有過相關(guān)報道，大多研究主要在生理水平上對葉藝機制進行探索[10,25-29]。近年來，許多石斛屬（Dendrobium）的葉藝突變體在市場上越來越受歡迎。鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）在自然環(huán)境和人工栽培條件下常出現(xiàn)葉藝現(xiàn)象[30]，這些葉藝鐵皮石斛是石斛品種改良與培育的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。此外，鐵皮石斛的高質(zhì)量基因組已經(jīng)公布[31]，這為研究鐵皮石斛葉藝現(xiàn)象的分子機制提供了便利與基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為鐵皮石斛葉藝突變體的無性系，其葉片上有大面積白色斑塊或條紋。本研究所用材料都培養(yǎng)在中國林業(yè)科學(xué)研究院溫室中，采光為自然光照，正常栽培管理。

1.2 顯微結(jié)構(gòu)觀察

1.2.1 葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察 分別取正常鐵皮石斛（WT）、葉藝鐵皮石斛葉子綠色組織（YYG）、葉藝鐵皮石斛葉藝白色組織（YYW），用雙面刀片快速切成薄片，放入有蒸餾水的玻璃皿中。選擇其中最薄的透明度最大的薄片做成臨時切片，在光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本）下觀察和拍照。

1.2.2 葉綠體超顯微結(jié)構(gòu)觀察 根據(jù)Li等[15]的方法，將實驗材料制備成切片；利用透射電鏡（JEOL，日本）對切片中的葉綠體顯微結(jié)構(gòu)進行觀察和拍照。

1.3 葉綠素及其前體物質(zhì)含量的測定

本研究采用邵勤等[32]的葉綠素提取和含量計算方法，對不同處理稱取等量實驗材料并研磨至粉末，然后利用80%丙酮進行葉綠素萃取。通過UV2310Ⅱ分光光度計分別測定提取液波長在663、646、470 nm下的OD值。最后，根據(jù)相關(guān)計算公式得到不同實驗處理的葉綠素含量。根據(jù)Bogorad[33]的方法對實驗樣品中膽色素原(Porphobilinogen,PBG)、尿 卟 啉 原 III (Uroporphyrinogen Ⅲ,UrogenIII)和糞卟啉 III(Coproporphyrinogen Ⅲ,CoprogenⅢ)進行提取和含量測定。根據(jù)Lee等[34]的方法對實驗樣品的原卟啉IX (Protoporphyrin IX,Proto IX)、鎂原卟啉IX(Mg-Protoporphyrin IX, Mg-Proto IX)和原葉綠素酸酯(Protochlorophyllide,Pchlide)進行提取和含量測定。每處理進行3個生物學(xué)重復(fù)測定，并利用Omiscshare tools (http://omicshare.com/tools/)對數(shù)據(jù)進行Student's pairedt-test。

1.4 葉綠素合成相關(guān)基因的qRT-PCR定量

1.4.1 總RNA提取和質(zhì)量檢測 利用改良的SDS法[35]提取實驗樣品中的總RNA。利用NanoDrop 2000微量分光光度計（Thermo Scientific Inc., USA）對RNA的質(zhì)量進行檢測，OD260/280≥1.8、OD260/230≥1.8和濃度大于100 ng·μL-1的RNA被用于下一步的反轉(zhuǎn)錄。

1.4.2 相關(guān)基因的qRT-PCR定量 利用EasyScript One Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix qPCR（全式金，中國）反轉(zhuǎn)錄試劑合成RNA的cDNA第一鏈。從已發(fā)表的鐵皮石斛基因組[31]中找與葉綠素合成相關(guān)的基因，利用NCBI的Primer-BLAST進行引物設(shè)計（表1）。以Dc18S作為內(nèi)參基因?qū)?shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)TaKaRa TB GreenTMPremixEx TaqTM試劑盒（TaKaRa, Japan）使用說明書設(shè)置LightCycler480 System（Roche,USA）的qRT-PCR運行程序進行基因的qRT-PCR定量。每個基因在每個處理中進行3個生物學(xué)重復(fù)測定，并利用Omiscshare tools (http://omicshare.com/tools/)對數(shù)據(jù)進行Student's pairedt-test。

表1 葉綠素合成相關(guān)基因的qRT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences of chlorophyll biosynthesis related genes for qRT-PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 13.0與Excel 2010對生理指標(biāo)進行統(tǒng)計和方差分析，基因定量采用Comparative CT(-ΔΔCt)法進行計算[36]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉藝突變體的顯微觀察比較

正常的鐵皮石斛葉片為全綠色（圖1a），而葉藝鐵皮石斛的葉片上則出現(xiàn)了大面積的白色條紋或斑塊（圖1b、c）。對葉片橫切面的顯微觀察結(jié)果顯示：正常鐵皮石斛（WT）和葉藝鐵皮石斛葉片綠色組織（YYG）的部位中充滿了綠色細胞（圖1d、e），而葉藝鐵皮石斛葉藝白色組織（YYW）的部位中則基本上看不到綠色細胞（圖1f）。對這些組織細胞的超顯微結(jié)構(gòu)觀察顯示：WT和YYG的葉綠體呈飽滿的半球形，其體內(nèi)富含排列整齊的基粒片層和類囊體基粒，淀粉顆粒少（圖2）；而YYW的葉綠體則呈干癟的三角形，體內(nèi)基粒片層和類囊體基粒數(shù)量稀疏且排列無規(guī)則，淀粉顆粒多（圖2）。這些結(jié)果顯示葉子呈綠色的WT和YYG富含大量的綠色葉綠體且具有相似的葉綠體細胞結(jié)構(gòu)，而YYW則與前兩者相反。

圖1 葉藝和正常鐵皮石斛的形態(tài)特征和葉片顯微觀察Fig. 1 The morphological characteristics and microscopic structure of normal and mutant D. catenatum leaves

圖2 石斛葉片葉綠體的超顯微結(jié)構(gòu)觀察Fig. 2 The ultrastructure of chloroplast in D. catenatum leaves

2.2 葉綠素、葉綠素合成前體物質(zhì)和類胡蘿卜素的含量測定

葉綠素和類胡蘿卜素含量測定顯示：WT和YYG之間的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量無明顯差異，但它們都顯著高于YYW（圖3）。這一結(jié)果顯示YYW的葉綠素合成受到了阻礙，并支持了其白化表型特征和顯微觀察YYW中幾乎沒有綠色細胞的結(jié)果。

圖3 野生型和突變型鐵皮石斛葉片中光合色素的含量Fig. 3 Photosynthetic pigments content of WT and mutant leaves

葉綠素合成的上游中間代謝物中，YYW的膽色素原含量是WT的84%，而尿卟啉原Ⅲ和糞卟啉原Ⅲ含量則分別是WT的109%和137%（圖4）。在葉綠素合成下游中間前體物質(zhì)中，WT和YYG的原卟啉IX、鎂原卟啉IX和原葉綠素酸酯含量是YYW的4.9～17.1倍，而它們二者之間的差距相較于YYW則較?。▓D4）。糞卟啉原Ⅲ是原卟啉IX和鎂原卟啉IX重要合成前體[15]。因此，這些結(jié)果顯示：YYW在合成葉綠素的過程中，原卟啉IX的合成受到了阻礙，中間產(chǎn)物無法正常流向葉綠素合成。

2.3 葉綠素生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達量測定

WT、YYG和YYW中葉綠素生物合成途徑中8個結(jié)構(gòu)基因的qRT-PCR結(jié)果（圖5）顯示：YYW中的尿卟啉原脫羧酶（Uroporphyrinogen decarboxylase, DcHEME）、糞卟啉原氧化脫羧酶（Coproporphyrinogen III oxidase, DcHEMF）、原卟啉原氧化酶（Protoporphyrinogen oxidase, DcHEMG）和鎂螯合酶H和鎂螯合酶H亞基（Mg chelatase H subunit, DcCHLH）的表達量都顯著低于WT和YYG。羥甲基后膽色素原合酶（Porphobilinogen deaminase, DcHEMC）的表達量在三者之間并無明顯差異，而YYG和YYW中的膽色素原合酶（Porphobilinogen Synthase, DcHEMB）、鎂螯合酶D亞基（Mg chelatase D subunit, DcCHLD）和鎂原卟啉IX甲基轉(zhuǎn)移酶（Mg protoporphyrin IX methyltransferase, DcCHLM）的表達量則都顯著低于WT。值得注意的是，HEMF和HEMG是合成原卟啉IX的關(guān)鍵酶，而CHLH和CHLD則是合成鎂原卟啉IX的關(guān)鍵酶[15]。

3 討論

大多數(shù)植物的葉片為綠色，但許多植物都有葉片白化的突變體，而這種葉片出現(xiàn)白化的突變現(xiàn)象是許多觀賞植物的重要觀賞性狀，具有很高的觀賞價值[15]。葉綠素是植物進行光合作用的主要物質(zhì)，同時它也是使植物組織呈現(xiàn)綠色的重要色素[37]。在許多植物的白化突變體中，其葉子的白化區(qū)域都出現(xiàn)了葉綠素積累量顯著下降[13,38-40]。本研究通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，YYW基本沒有綠色細胞，同時其葉綠體細胞結(jié)構(gòu)畸形且體內(nèi)基粒片層和類囊體基粒數(shù)量稀疏且排列無規(guī)則。許多研究表明，植物葉色的突變都伴隨著葉綠體細胞結(jié)構(gòu)的改變和體內(nèi)類囊體基粒的無序排列[11,41-42]。因此，葉綠素含量的下降是導(dǎo)致葉藝鐵皮石斛葉片出現(xiàn)白色條紋或斑塊的主要原因。此外，糞卟啉原Ⅲ在YYW中的含量顯著高于WT和YYG，而糞卟啉原Ⅲ的下游產(chǎn)物原卟啉IX、鎂原卟啉IX和原葉綠素酸酯在WT和YYG中的含量是YYW的4.7～17.1倍。這進一步表明，YYW的葉綠素合成從糞卟啉原Ⅲ下游產(chǎn)物合成開始就受到了阻礙，而這可能是導(dǎo)致YYW中葉綠素?zé)o法正常合成的主要原因。

葉綠素生物合成途徑中關(guān)鍵酶編碼基因表達量的變化會直接影響葉綠素在植物組織的積累量，從而改變植物組織的顏色表型[15-17,43]。本研究中，葉綠素合成途徑中的DcHEMF、DcHEMG、DcCHLH和DcCHLM在YYW中的表達量顯著低于正常葉片。在葉綠素合成途徑中，糞卟啉原Ⅲ經(jīng)過HEMF和HEMG的催化后會生成原卟啉，然后分別通過CHLD、CHLH和CHLI進一步形成鎂原卟啉IX[17]。值得注意的是，葉藝鐵皮石斛中糞卟啉原Ⅲ含量顯著高于正常葉片，而原卟啉和鎂原卟啉IX含量則顯著低于正常葉片。前人研究表明，金魚草（Antirrhinum majus）葉片的黃綠表型是由Tam3插入使ChlH基因失去活性所導(dǎo)致[44]。水稻（Oryza sativa）葉片的突變體中，由于T-DNA插入到line 9-07117的鎂螯合酶大亞基ChlH中，使其無法正常轉(zhuǎn)錄翻譯，導(dǎo)致水稻葉片失綠[18]。銀杏（Ginkgo biloba）葉片的黃化突變體中，GbPPO、GbCHLD、GbCHLH和GbCHLI在黃化葉片中的表達量下調(diào)，同時其糞卟啉原Ⅲ含量顯著高于正常葉片，而原卟啉IX和鎂原卟啉IX的含量則相反[15]。本研究中，DcHEMF、DcHEMG和DcCHLH在YYW中的低表達使糞卟啉原Ⅲ無法正常流向葉綠素合成，造成葉綠素的積累量減少，最終導(dǎo)致葉片失綠。這些研究結(jié)果為今后石斛屬的葉藝性狀改良提供了理論依據(jù)和分子基礎(chǔ)。

圖4 野生型和突變型鐵皮石斛葉片中葉綠素合成的中間產(chǎn)物含量Fig. 4 The content of chlorophyll intermediates in WT and mutant leaves

圖5 野生型和突變體石斛葉片中葉綠素合成相關(guān)基因的表達量變化Fig. 5 The relative expression of some chlorophyll biosynthesis relative genes in WT and mutant leaves

4 結(jié)論

DcHEMF、DcHEMG和DcCHLH在葉藝鐵皮石斛葉片白色區(qū)域中的低表達使糞卟啉原Ⅲ無法正常流向葉綠素合成，這導(dǎo)致了葉綠素含量的下降，是使鐵皮石斛出現(xiàn)葉藝表型的主要原因。