HPLC法同時測定8種三七樣品中5種皂苷成分的含量

李瑞婷　婁燈吉　姚星宇　向巧　鄒玉林　崔秀明　楊曉艷

摘要 [目的]建立同時測定8種不同三七樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd這5種單體皂苷的HPLC方法。[方法]采用Welchrom C18色譜柱（250 mm × 4.6mm，5 μm），乙腈-水梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長203 nm。[結(jié)果]三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd線性關(guān)系良好（R2>0.999 1），方法重復性及回收率均符合要求。[結(jié)論]不同三七樣品的皂苷含量具有差異顯著性，此法可為三七藥材質(zhì)量優(yōu)劣的判斷提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 三七;皂苷成分;HPLC;含量測定

中圖分類號 R 284文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）16-0184-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.052

Simultaneous Determination of Five Saponins in Eight Panax notoginseng Samples by HPLC

LI Rui-ting1，2，LOU Deng-ji3，YAO Xing-yu4 et al （1.Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming，Yunnan 650500; 2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Panax notoginseng，Kunming，Yunnan 650500;3.School of Chemical，Biological and Environmental Sciences，Yuxi Normal University，Yuxi，Yunnan 653100;4.CSPC-NBP Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shijiazhuang，Hebei 052160）

Abstract [Objective]To establish a HPLC method for simultaneous determination of notoginsenoside R1，ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd in eight Panax notoginseng.[Method]Welchrom C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm） was used for gradient elution of acetonitrile with water at a flow rate of 1.0 mL/min，column temperature of 30 °C and detection wavelength of 203 nm.[Result]The linear relationships of notoginsenoside R1，ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd were good （R2>0.999 1）.The repeatability and recovery of the method met the requirements.[Conclusion]The 8 Panax notoginseng samples have significant differences in the content of saponins，and this method can provide a theoretical basis for judging the quality of Panax notoginseng.

Key words Panax notoginseng;Ginsenoside; HPLC;Content determination

基金項目 國家重點研發(fā)計劃（2017YFC1701900）;國家自然科學基金項目（21562029，31960371）;云南省重大科技專項（2017ZF001，2018ZF014）。

作者簡介 李瑞婷（1994—），女，遼寧大連人，碩士研究生，研究方向：生物轉(zhuǎn)化。*通信作者，副教授，博士，碩士生導師，從事中藥化學成分分離及分析工作。

收稿日期 2019-12-24;修回日期 2020-02-20

三七，原產(chǎn)于云南和廣西交接地區(qū)的亞熱帶山地長綠闊葉林中，為林下陰生植物，適宜于冬暖夏涼的氣候，喜半陰潮濕的環(huán)境[1]，是我國名貴的傳統(tǒng)中藥材，其根和根莖可入藥，味甘、微苦，性溫，歸肝、胃經(jīng)，具有化瘀止血、消腫定痛的功效[2] ，用于治療咯血、吐血、衄血、便血、崩漏、外傷出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛等，是復方丹參滴丸、云南白藥、片仔癀、復方三七口服液等常見中藥制劑的主要成分之一，目前以三七為配方進入《國家基本藥物目錄》和《國家中藥保護品種目錄》的制劑達20余種[3]。三七通常于秋季花開前采挖，洗凈，干燥，備用。三七根部主要分為主根、根莖、支根及須根。三七主根呈類圓錐形或圓柱形，長1～6 cm，直徑1～4 cm，頂端有莖痕，周圍有瘤狀突起;三七根莖習稱“剪口”，位于三七主根及地上莖之間，呈不規(guī)則的皺縮塊狀或條狀，表面有數(shù)個明顯的莖痕及環(huán)紋;三七支根又稱大根，習稱“筋條”，呈圓柱形或圓錐形，長2～6 cm，上端直徑約0.8 cm，下端直徑約0.3 cm;三七須根是生長在三七支根上的須狀根，中部直徑小于0.4 cm。

近代研究表明，三七中的皂苷類成分是其主要的藥效成分之一，也是衡量三七內(nèi)在質(zhì)量優(yōu)劣的重要標準，其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 5種皂苷是三七的主要成分，約占總皂苷含量的80%[4]。中國藥典規(guī)定三七主根及根莖為入藥部位，皂苷含量較高，而三七大根及須根皂苷含量較少，價格較為便宜，為非藥用部位。此外，三七不同部位隨著生長年限的增長皂苷含量有一定量的增加，多以三年生主根或根莖入藥，而一年生、兩年生、大根、筋條等由于活性成分含量較低，被稱為是不合適的三七樣品[5]。

目前市場上三七粉末飲片品牌眾多，規(guī)格繁雜，質(zhì)量良莠不齊，市售三七粉末飲片中符合2015版《中國藥典》規(guī)定的合格產(chǎn)品，僅約占市場份額的75%[6]。市場上存在的三七不合格藥品多是以假亂真、以次充好或者用非藥用部位充當藥用部位。該試驗抽取的8種三七樣本包含了不同年份、不同藥用部位、不同產(chǎn)地、不同工藝以及病變?nèi)?，采用高效液相色譜法，測定樣本中5種皂苷的含量，為鑒定樣品質(zhì)量的優(yōu)劣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 三七樣品。

供試的8種三七樣品均于2018年11月在云南省文山壯族苗族自治州采樣或購買所得，經(jīng)昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院崔秀明研究員鑒定為五加科人參屬植物三七（Panax notoginseng （Burkill） F.H.Chen ex C.H.），8種樣品全部為干三七，包括大根（三七的筋條又被稱為“三七大根”，采收加工后稱筋條，是由塊根上生長出的較粗的支根，隨著三七年限增加而長粗、伸長、增多）、筋條（采收加工前的大根）、高溫烘烤過的主根（三年生）、文山一年生主根、兩年生主根、三年生主根、霉三七主根（三年生）、根腐病三七主根（三年生）。

1.1.2 藥物與試劑。

三七皂苷R1（批號：wkq18061104）、人參皂苷Rg1（批號：wkq18050401）、人參皂苷Re（批號：wkq18121407）、人參皂苷Rb1（批號：wkq19012107）、人參皂苷Rd（批號：wkq18030803），以上5種單體人參皂苷對照品，全部購自四川省維克奇生物科技有限公司;乙腈為色譜純，其他有機試劑均為分析純;水為超純水。

1.1.3 儀器設(shè)備。

高效液相色譜儀（美國Agilent 1260 Infinity），包括四元泵（G1311B）、自動進樣器（G1329B）、柱溫箱（G1316A）、紫外檢測器（G1314F）;BL10-250A型超聲波清洗機 （上海比朗儀器有限公司）;FW-135型搖擺式中藥粉碎機（上海隆拓儀器設(shè)備有限公司）;CP114型電子分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）;UPT-I-20T優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備。

分別精密稱取三七皂苷R1以及人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd標準品6.03、6.99、2.10、5.98、3.01 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配成質(zhì)量濃度分別為0.603、0.699、0.210、0.598、0.301 mg/mL的混合對照品貯備液。

1.2.2 供試品溶液的制備。

參照曾憲彩等[7]和武雙等[8-9]的方法，稱量樣品粉末0.3 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，精密加75%甲醇25 mL，密塞后稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放置過夜。次日于超聲波清洗機上常溫下超聲提取30 min，放冷，稱定重量，用75%甲醇補足減少的重量，搖勻。轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)用離心機進行離心（轉(zhuǎn)速3 500 r/min，時間20 min），將上清液與樣品固體分離，取上清液過0.45 μm有機膜過濾于2.0 mL進樣瓶內(nèi)，即得三七總皂苷供試品溶液。

1.2.3 色譜條件。色譜柱為Welchrom C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為水（A）-乙腈（B）;梯度洗脫（表1）;流速1.0 mL/min;檢測波長203 nm;柱溫30 ℃;進樣量20 μL。利用DAD檢測器在190～400 nm波長范圍內(nèi)對對照品進行波長掃描，確定樣品測定的最大吸收波長。

1.2.4 方法學考察。

1.2.4.1 系統(tǒng)適應性試驗。分別吸取對照品溶液及供試品溶液，在“1.2.3”色譜條件下，注入液相色譜儀進行測定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應性。

1.2.4.2 線性關(guān)系考察。每次精密吸取“1.2.1”對照品儲備液1 mL，依次稀釋2、3、6、12、30、60、100倍制備系列混合對照品溶液，分別進樣20 μL注入色譜儀，按“1.2.3”色譜條件進行測定，記錄各對照品的峰面積，以對照品濃度（X，mg/mL）為橫坐標、色譜峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸。

1.2.4.3 精密度試驗。

吸取“1.2.1”混合對照品溶液20 μL，重復進樣3次，測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd這5種皂苷成分的峰面積，并計算其RSD。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗。

取同一樣品（文山三年生主根），按照“1.2.2”方法平行制備供試品溶液3份，室溫放置，按“1.2.3”色譜條件分別于0、4、8、12、16、24 h進樣分析，分別依法測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd這5種皂苷成分的峰面積，并計算其RSD。

1.2.4.5 重復性試驗。

取同一樣品（文山三年生主根），按照“1.2.2”方法平行制備供試品溶液3份，在“1.2.3”色譜條件下進行分析，測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的峰面積，并計算其RSD。

1.2.4.6 加樣回收率考察。

取同一種含量已知的三七樣品3份，分別等體積加入與樣品中5種皂苷成分含量相當?shù)膶φ掌啡芤?，按?.2.2”方法制備供試品溶液，測出三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量，并計算其加樣回收率及RSD。

1.2.5 樣品的含量測定。取8種不同的三七樣品，按照“1.2.2”方法制備供試品溶液，按照“1.2.3”色譜條件，測得8種三七樣品中5種單體皂苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 系統(tǒng)適用性試驗。在“1.2.3”色譜檢測波長及相應色譜條件下，混合對照品和樣品中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的分離度均較好，經(jīng)計算樣品與其他組分峰的分離度>1.5，理論塔板數(shù)按三七皂苷R1計算不低于4 000，符合藥典測定要求。對照品及樣品的高效液相色譜圖見圖1。

2.1.2 線性關(guān)系考察。分別以對照品濃度（X，mg/mL）為橫坐標、色譜峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果表明三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd這5種皂苷成分的線性關(guān)系均良好（表2）。

2.1.3 精密度試驗。按照“1.2.4.3”操作，重復進樣3次，得出三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd峰面積的RSD值分別為1.24%、2.42%、1.62%、1.75%、2.08%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.4.4”操作，得出三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd這5種皂苷成分峰面積的RSD值分別為0.81%、0.28%、1.12%、2.37%、3.23%，表明這5種皂苷成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復性試驗。按照“1.2.4.5”操作，得出三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd峰面積的RSD值分別0.60%、1.73%、0.59%、1.26%、0.95%，表明該方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收試驗。按照“1.2.4.6”操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的平均回收率均在95%～105%，RSD分別為0.71%、1.09%、2.70%、0.78%、0.07%。

2.2 含量測定 從不同三七樣品的皂苷含量（表4）可以看出，生長年限不同的三七所含的皂苷含量是不同的，隨著生長年限的增加所含的皂苷含量是依次增加的，其中，三年生三七>二年生三七>一年生三七;此外，即便同樣都是三年生三七，不同部位皂苷含量也是不同的，其皂苷含量從高到低依次為主根、大根、筋條;最后，得病的根腐病三七、發(fā)霉的三七和高溫烘烤的三七與正常樣品（三年生三七主根）相比其皂苷含量均會有不同程度的降低。

3 結(jié)論與討論

高效液相色譜法對三七藥材及其提取物的含量測定、質(zhì)量分析，具有快速、分離效能高、結(jié)果準確可靠、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢，廣泛應用于三七藥材、提取物及其制劑的研究中，三七中的單體皂苷三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd含量較高，約占三七總皂苷的80%，這5種單體皂苷含量的高低可以在一定程度上反映三七藥材質(zhì)量的優(yōu)劣[10]。但三七中皂苷類成分的HPLC檢測分析，中國藥典以三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Rg1這3種皂苷作為指標性成分進行定量分析[11]，該研究比較了三七皂苷R1以及人參皂苷Rb1、Rg1、Re、Rd這5種單體皂苷的含量，更為全面一些。

由于市場上三七飲片或藥品多以粉末的形式出現(xiàn)，品牌眾多，規(guī)格繁雜，質(zhì)量良莠不齊，且無法從表面形態(tài)判斷其質(zhì)量優(yōu)劣。為了能更客觀地判斷不同三七的質(zhì)量，該試驗收集了8種不同的三七樣品（三年生的合格樣品和其他7種不合格的樣品），對其中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量進行了測定。該試驗的8種樣品中，一年生的三七主根皂苷含量遠低于《中國藥典》規(guī)定的5.0%，且低于其他情況致不合格的三七樣本，可見一年生三七藥用價值不高，此外，三年生正常三七主根的皂苷含量最高，病變及過度加工的三年生三七主根樣品中5種皂苷含量相較于正常三年生三七主根樣品中的皂苷含量有所降低，該試驗對不同情形下的三七樣本進行了5種皂苷含量的測定，并進行了比較，為三七質(zhì)量的優(yōu)劣判斷提供一定的理論指導。

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