黃芪對(duì)肝纖維化大鼠肝損傷保護(hù)作用及機(jī)制研究*

雷 玲，閔 珺，劉 鋒，肖秀清，杜 凡

1.南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院(南昌 330008)；2.南昌市青山湖區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局(南昌 330029)；3.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院(廣州 510630)

肝纖維化(Hepatic fibrosis，HF)是肝臟應(yīng)對(duì)慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)[1-2]。 也是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié)，是逆轉(zhuǎn)病情的一個(gè)關(guān)鍵階段[3]。近年的肝病領(lǐng)域諸多研究均在圍繞肝纖維化發(fā)生及逆轉(zhuǎn)機(jī)制為熱點(diǎn)展開，相對(duì)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)缺乏安全有效的治療手段，而中醫(yī)藥治療肝病有長(zhǎng)期臨床實(shí)踐，為其在抗纖維化方面的研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，中醫(yī)藥多途徑、多靶點(diǎn)、多層次的特點(diǎn)在抗HF方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。肝郁脾虛是慢性肝纖維化的常見類型，常與血瘀一起存在于整個(gè)慢性肝病過程中。軟肝健脾丸是以黃芪為主要成分之一的治療慢性乙型肝炎肝纖維化的常用藥物，軟肝健脾丸的臨床研究結(jié)果顯示，其能顯著改善慢性肝纖維化患者肝功能和臨床癥狀及肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)。黃芪具有抗HF作用，可部分逆轉(zhuǎn)模型動(dòng)物中的肝纖維化[4]。 然而，HF的逆轉(zhuǎn)過程十分復(fù)雜，影響因素眾多，確切機(jī)制仍不甚明了。

MAPK激酶-3 (MAPK kinase 3，MKK3)是一組分布于胞漿中具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶，其通過連接細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵調(diào)控因子參與基因表達(dá)，經(jīng)雙重磷酸化激活后可參與細(xì)胞內(nèi)多種生理過程，對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、癌變等方面都具有重要的意義。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路是MAPK家族的重要成員，其在肝纖維化過程中的作用越來越受到關(guān)注[5-6]。p38MAPK的激活因子首先要激活上游的促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)再激活MKK3/6，磷酸化蘇氨酸和絡(luò)氨酸殘基從而使p38MAPK活化[7]?；罨膒38MAPK可作用于靶基因調(diào)控下游多種酶及轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)活性。轉(zhuǎn)錄激活因子-2 (Activating transcription factor 2，ATF-2)是p38MAPK通路的重要下游因子，其特定堿基被p-p38MAPK磷酸化后表現(xiàn)出明顯增加的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性，激活下游底物從而誘發(fā)特定基因的表達(dá)，在肝纖維化過程中起重要作用能促進(jìn)肝纖維化過程，因此抑制p38MAPK通路對(duì)治療肝纖維化有積極的作用[8-10]。

為探討黃芪對(duì)肝纖維化損傷大鼠的保護(hù)作用，本研究擬通過CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，檢測(cè)p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)上下游蛋白的表達(dá)情況，探討p38MAPK信號(hào)通路在黃芪后處理大鼠肝纖維化損傷中的作用，闡明肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，為臨床上應(yīng)用黃芪治療肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量170～230 g，購(gòu)于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)科部,每3只一籠飼養(yǎng)于24 ℃恒溫恒濕環(huán)境中，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)的大鼠專用飼料及無菌水。

1.2 主要試劑：CCl4(北京索萊寶公司)；黃芪分析標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)HPLC檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.5% (源葉生物公司)；復(fù)方鱉甲軟肝片(福瑞醫(yī)療公司)；HE、Masson染色試劑盒(碧云天公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)檢測(cè)試劑盒和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase，AST)檢測(cè)試劑盒(Sigma-aldrich公司)；總膽紅素(Total bilirubin，TBIL)Elisa試劑盒(上海奧陸)；大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、MKK3、p-p38MAPK(Cell Signal公司)；GAPDH、p-AFT-2一抗(Santa Cruz公司)；WB二抗(博士德公司)；核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)提取試劑盒(Gibco公司)；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(寶生物公司)；根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物有限公司合成引物。

1.3 主要儀器：Multiskan ascent酶標(biāo)儀(Thermo scientific公司)；可見光成像系統(tǒng)(Olympus公司)；全自動(dòng)生化分析儀(Beckman公司)；E-Gel imager凝膠成像儀(Invitrogen公司)；Mini-protean tetra system垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀、Minitrans-bolt小型濕轉(zhuǎn)印槽、ChemiDocTMXRS加凝膠成像系統(tǒng)、伯樂電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型的建立與處理：①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、肝纖維化模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和三種不同劑量黃芪后處理組，每組各6只大鼠。②建立動(dòng)物模型:第1～4周連續(xù)建模，肝纖維化模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和黃芪后處理組以6 ml/kg的劑量2次/周，皮下注射含20% CCl4的玉米油溶液建立肝纖維化損傷大鼠模型。正常對(duì)照組2次/周，皮下注射6 ml/kg的玉米油溶液。③藥物后處理第5～9周，藥物后處理：建模完成后，連續(xù)給藥5周。正常對(duì)照組和肝纖維化模型組大鼠每日用生理鹽水灌胃1次。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠每日用鱉甲軟肝以10 ml/kg的劑量灌胃1次。 黃芪后處理組大鼠每日用黃芪溶液灌胃1次，分為 0.1 mg/kg小劑量組、0.5 mg/kg常規(guī)劑量(0.5 mg/kg的藥量為臨床應(yīng)用劑量)組和2.5 mg/kg大劑量組灌胃。所有實(shí)驗(yàn)大鼠每周日稱量大鼠質(zhì)量，然后根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化來調(diào)整下1周的藥物處理劑量。末次灌藥后，給予大鼠禁食24 h禁水12 h處理。

2.2 各組大鼠肝功能檢測(cè)：麻醉大鼠后腹主動(dòng)脈取血，4000 r/min離心15 min分離收集血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，檢測(cè)各組大鼠血清中ALT、AST、 TBIL水平。

2.3 RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中5種主要致纖維化因子：p38MAPK、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 (Transforming growth factor β1，TGF -β1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Connective tissue growth factor，CTGF)和Ⅳ型膠原蛋白信使核糖核酸(Collegen Ⅳ mRNA)表達(dá)變化。RNA提?。簩⒈４嬗?80 ℃冰箱中的各組大鼠肝臟組織按照Trizol試劑盒操作步驟依次勻漿、離心、提純、定量。取3 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，依次加入dd H2O 10 μl、RNA模板4 μl、5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 4 μl、oligo(dT)0.5 μl、dNTPs 0.5 μl、逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，37 ℃孵育1 h，95 ℃孵育5 min。RT-PCR擴(kuò)增:PCR引物設(shè)計(jì)如下：GADPH的上游引物為5’GTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物為5’TCCCATTCTCAGCCTTGACA-3’；p38MAPK的上游引物為5’AGACGAATGGAAGAGCCTGA-3’，下游引物為5’GGGATGGACAGAACAGAAGC-3’；TGF-β1的上游引物為5’ATTCCTGGCGTTACCTTGG-3’，下游引物為5’AGCCCTGTATTCCGTCTCCT-3’；CTGF的上游引物為5’GATGCCAGGAGAAAGACAGG-3’，下游引物為5’ACCGAGTGGAGGACACACAC-3’；α-SMA的上游引物為5’AGGGAGTGATGGTTGGAATG-3’，下游引物為5’GGTGATGATGCCGTGTTCTA-3’；Collegen Ⅳ的上游引物為5’GGCTTTCCAGGGTTACAAGG-3’，下游引物為5’GAAGTCCAGGTTCTCCAGCA-3’。逆轉(zhuǎn)錄合成的DNA按照以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃、5 min預(yù)變性，94 ℃、30 s變性，55 ℃～60 ℃、45 s退火，72 ℃、45 s延伸32個(gè)循環(huán)，72 ℃、7 min最終延伸。RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-△Ct方法計(jì)算。選擇出治療大鼠肝纖維化效果最佳的黃芪濃度，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 HE和Masson染色法測(cè)定各組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化：取各組大鼠肝臟組織肝大葉縱切(每只大鼠取位置大致相同的肝臟組織)1～2 mm厚，用4%中性甲醛溶液固定48 h，制作3 μm厚度的病理石蠟切片，嚴(yán)格按照HE和Masson染色試劑盒說明書操作進(jìn)行染色。顯微鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)及膠原纖維的表達(dá)量變化。

2.5 Western Blot法檢測(cè)MAPK通路上下游蛋白表達(dá)水平：分別取正常對(duì)照組、肝纖維化模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和黃芪后處理組大鼠肝臟組織約100 mg，加入1 ml的RIPA蛋白裂解液裂解快速勻漿、裂解，離心力12000 g、離心速度5978 rpm，離心2 min后取上清(蛋白)分裝于0.5 ml離心管中，加入loading后置于75 ℃水浴10 min使蛋白變性，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取每組總蛋白5 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。加入一抗后4 ℃孵育過夜，TBST清洗4次，5 min/次，加入與HRP偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h，TBST清洗次后ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色，放射自顯影保存圖片。按照以上步驟，分別檢測(cè)GAPDH、p38MAPK、MKK3、p-AFT-2的表達(dá)水平， 定量分析結(jié)果以p38MAPK、MKK3、p-AFT-2與GAPDH內(nèi)參蛋白的相對(duì)表達(dá)量比值表示。成像結(jié)果采用Quality One V 4.6軟件進(jìn)行半定量分析處理，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

結(jié) 果

1 各組大鼠血清中AST、ALT活性和TBIL比較 陽(yáng)性對(duì)照組大鼠為肝纖維化損傷大鼠模型建立后給予鱉甲軟肝進(jìn)行灌胃治療，鱉甲軟肝目前為臨床上治療肝纖維化的藥物。陽(yáng)性對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，大鼠血清中AST、ALT活性和TBIL水平顯著升高，證明陽(yáng)性對(duì)照組造模成功，且陽(yáng)性對(duì)照組與肝纖維化組相比，大鼠血清中AST、ALT活性和TBIL水平顯著降低，證明鱉甲軟肝治療效果有效。當(dāng)黃芪濃度為0.5 mg/kg 劑量處理時(shí)，大鼠血清中AST、ALT活性和TBIL水平與陽(yáng)性對(duì)照組水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，證明在黃芪濃度為0.5 mg/kg時(shí)，其治療效果與鱉甲軟肝相同。與肝纖維化模型組相比，0.1 mg/kg黃芪后處理組與肝纖維化模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。0.5 mg/kg劑量的黃芪后處理組大鼠血清中AST、ALT的活性和TBIL的水平降低，與肝纖維化模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明0.5 mg/kg高劑量的黃芪對(duì)大鼠肝纖維化損傷有顯著的保護(hù)作用。將黃芪濃度增大到2.5 mg/kg劑量時(shí)，大鼠血清中AST、ALT的活性和TBIL的水平與0.5 mg/kg劑量的黃芪組持平，說明2.5 mg/kg高劑量的黃芪對(duì)大鼠肝纖維化損傷有顯著的保護(hù)作用且對(duì)大鼠肝臟組織無明顯藥物毒性損傷。見表1。

表1 各組大鼠血清中AST、ALT活性和TBIL水平比較

2 RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中主要致纖維化因子mRNA表達(dá)水平 與正常對(duì)照組相比，肝纖維化模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、黃芪后處理組中p38MAPK、TGF-β1、α-SMA、CTGF和Collegen Ⅳ mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)，說明大鼠肝纖維化損傷。與肝纖維化模型組相比，0.1 mg/kg黃芪后處理組與肝纖維化模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，0.5 mg/kg黃芪后處理組中5種mRNA表達(dá)水平均降低，與肝纖維化模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明0.5 mg/kg劑量的黃芪對(duì)大鼠肝纖維化損傷有顯著的保護(hù)作用。將黃芪濃度增大到2.5 mg/kg劑量時(shí)，大鼠血清中纖維化因子mRNA表達(dá)水平與0.5 mg/kg劑量的黃芪組持平，說明2.5 mg/kg高劑量的黃芪對(duì)大鼠肝纖維化損傷有顯著的保護(hù)作用且對(duì)大鼠肝臟組織無明顯藥物毒性損傷。見表2。

表2 各組大鼠肝臟中主要致纖維化因子mRNA表達(dá)水平比較

3 HE和Masson染色法測(cè)定各組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化 正常對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)排列規(guī)則，中央靜脈區(qū)只有少量膠原纖維沉積，無炎性浸潤(rùn)。而肝纖維化模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝細(xì)胞排列紊亂，正常結(jié)構(gòu)消失，可見廣泛浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞，中央靜脈周圍及匯管區(qū)纖維沉積形成間隔，肝小葉和肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)破壞。與肝纖維化模型組相比，0.5 mg/kg黃芪后處理組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)破壞不明顯，肝細(xì)胞形態(tài)排列較規(guī)則，肝組織炎性浸潤(rùn)不明顯，且少見膠原纖維沉積，大鼠肝組織結(jié)構(gòu)損傷程度及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況較陽(yáng)性對(duì)照組更輕(圖1、2)。

注：圖中箭頭所示位置為炎性浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)破壞

注：圖中箭頭所示位置為膠原纖維沉積

4 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中蛋白表達(dá)變化 由表3(圖3)可知，與正常對(duì)照組相比，肝纖維化模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、0.5 mg/kg黃芪后處理組中p-p38MAPK、MKK3、p-AFT-2蛋白表達(dá)量均升高(P<0.05)；與肝纖維化模型組相比，0.5 mg/kg黃芪后處理組中p-p38MAPK、MKK3、p-AFT-2蛋白表達(dá)量均降低(P<0.05)，且與陽(yáng)性對(duì)照組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 各組大鼠肝臟組織中蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

A:正常對(duì)照組;B:肝纖維化模型組;C:陽(yáng)性對(duì)照組;

討 論

肝纖維化作為大多數(shù)慢性肝病共有的病理特征，其表現(xiàn)為肝內(nèi)結(jié)締組織增生與降解不平衡導(dǎo)致的沉積，是肝臟對(duì)各種原因所致肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)[11]。近年來中藥在肝纖維化治療中的療效得到證實(shí)[12]。越來越多的研究表明，成功的抗纖維化治療能夠阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化[13-14]。本研究進(jìn)一步探討了黃芪通過“化瘀通絡(luò)”的作用干預(yù)肝纖維化“瘀血阻絡(luò)”效果研究，深化對(duì)中醫(yī)絡(luò)病理論的認(rèn)識(shí)。本研究采用CCl4皮下注射法誘導(dǎo)建立肝纖維化動(dòng)物模型，觀察黃芪對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。p38MAPK是MAPK家族中最主要、研究最深入的成員之一，在機(jī)體應(yīng)激和炎癥反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮極其重要的作用。它可因生理性應(yīng)激、脂多糖、滲透性應(yīng)激和紫外線照射等而激活，在發(fā)育和疾病發(fā)生過程中起重要作用。MKK3是p38MAPK上游激活物，p38MAPK被磷酸化激活后轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的物質(zhì)結(jié)合，可激活下游底物從而誘發(fā)特定基因的表達(dá)，在肝纖維化過程中起重要作用。AFT-2是p38MAPK的主要作用底物。p38MAPK可通過激活調(diào)節(jié)包括TGF -β1、α-SMA等多種炎癥因子的基因表達(dá)?；罨疉FT-2有助于調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、免疫應(yīng)答、應(yīng)激反應(yīng)、致癌性轉(zhuǎn)化、凋亡的基因轉(zhuǎn)錄[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪能顯著降低實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝臟功能和結(jié)構(gòu)損傷，對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝損傷具有有效保護(hù)作用。黃芪能顯著降低肝纖維化大鼠肝臟中p38MAPK的上游激活因子MKK3、磷酸化p38MAPK和p38MAPK的下游轉(zhuǎn)錄因子AFT-2的表達(dá)。因此我們推測(cè)，黃芪可以調(diào)控肝纖維化大鼠肝臟中p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路上下游相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制致纖維化因子的表達(dá)，抑制肝纖維化的形成。