308 nm準(zhǔn)分子光對(duì)小鼠濕疹模型表皮及Th細(xì)胞因子的影響

蔡海斌，徐順明，曹艷云，徐徉

（上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院，上海201299）

濕疹是皮膚科常見疾病，臨床上多選擇外用糖皮質(zhì)激素制劑、口服抗組胺藥物等進(jìn)行治療。近年來，308 nm準(zhǔn)分子光已經(jīng)廣泛應(yīng)用于銀屑病、斑禿、白癜風(fēng)等的治療[1]，同樣用于特應(yīng)性皮炎、濕疹的治療也取得了不錯(cuò)的療效[1-2]，但至今為止，308 nm準(zhǔn)分子光治療濕疹的作用機(jī)制仍不明確。本研究通過2，4-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB）激發(fā)，建立BALB/C小鼠的濕疹模型，通過308 nm準(zhǔn)分子光照射治療，觀察其對(duì)小鼠濕疹模型表皮厚度的變化及皮損中白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-9、IL-10和IL-17等細(xì)胞因子表達(dá)情況，初步探討308 nm準(zhǔn)分子光治療濕疹的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 清潔級(jí)BALB/C小鼠35只，雄性，7～9周齡，體質(zhì)量23～28 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，由上?？得魉幍聞?dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度控制在50%～60%，晝夜時(shí)間控制在各12 h，自由進(jìn)食與飲水。所有實(shí)驗(yàn)遵循國家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用、福利和倫理學(xué)要求等項(xiàng)規(guī)定。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

1.2.1 主要試劑 2，4-二硝基氯苯（西格瑪奧德里奇有限公司，貨號(hào)237329）、IL-2抗體（Servicebio公司、貨號(hào) GB11114）、IL-9抗體（Servicebio公司，貨號(hào) GB11684）、IL-10抗體（Servicebio公司，貨號(hào)GB12108）、IL-17 抗體 （Servicebio 公司，貨號(hào)GB11110）、抗小鼠二抗（Servicebio公司，貨號(hào)G1216）和DAB顯色試劑盒（Servicebio公司，貨號(hào)G1212-200）、莫米松乳膏（上海通用藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20040853）。

1.2.2 主要設(shè)備 308 nm準(zhǔn)分子光治療儀（GSD公司GP908A），光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯CH20），石蠟切片機(jī)（徠克公司/SQ2125），石蠟切片機(jī)（德國LEICA公司），組織漂烘片機(jī)（常州市雅博電子設(shè)備有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 小鼠濕疹模型的制備與分組 將35只BALB/C小鼠采用DNCB外涂法造模[3]。具體造模方法為：先隨機(jī)選取5只小鼠建模：在所有小鼠背部皮膚剃毛（面積2 cm×3 cm），于第1天開始用DNCB連續(xù)刺激4 d，1周后重復(fù)刺激4 d，建模成功，符合濕疹皮損要求后，在建模部位皮損區(qū)皮膚切片做組織病理觀察是否建模成功，確認(rèn)建模成功后對(duì)另外30只小組按上述建模方法進(jìn)行，按隨機(jī)數(shù)字法分成308 nm準(zhǔn)分子光治療組（A組）和莫米松治療組（B組）及模型組（C組），每組各10只。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 ①A組：模擬患者治療流程，首先確定小鼠最小紅斑量（Minimalerythemaldose，MED），根據(jù)MED值選擇治療起劑量（本實(shí)驗(yàn)初始照射劑量為75 mJ/cm2），再根據(jù)治療反應(yīng)逐漸增加治療劑量，劑量調(diào)整參考設(shè)備生產(chǎn)商推薦治療劑量，隔天治療1次，連續(xù)治療10次，記錄每次光照劑量及皮損情況。②B組：皮損處外用莫米松1次/d，至A組治療結(jié)束，共19 d。③C組：實(shí)驗(yàn)期間不給予任何特殊處理。

1.3.3 組織病理切片及免疫組化染色 治療結(jié)束后，所有入組小鼠在造模區(qū)域分別取組織塊制備成組織蠟塊，進(jìn)一步觀察皮損組織病理變化，免疫組化染色根據(jù)Servicebio公司提供的鼠抗體免疫組化試劑盒的說明嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)操作流程進(jìn)行。

1.3.4 表皮厚度測(cè)量 表皮厚度測(cè)量參照黑色素瘤中Breslow厚度的測(cè)量方法。測(cè)量時(shí)測(cè)量顆粒層最表淺處至表皮基底層底部最深處之間的垂直距離，測(cè)量結(jié)果用μm記錄，測(cè)量時(shí)先通過切片掃描儀把HE切片進(jìn)行掃描存檔，然后應(yīng)用Image Scoper軟件自帶測(cè)距功能進(jìn)行測(cè)量。

1.3.5 免疫組化結(jié)果判定 對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，即從陽性細(xì)胞數(shù)百分比及細(xì)胞著色程度2項(xiàng)計(jì)分：①陽性細(xì)胞百分比：隨機(jī)選擇400倍光鏡下的3個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，取其平均值分0～4級(jí)：0級(jí)為無色，1級(jí)為＜10%的細(xì)胞染色，2級(jí)為10%～20%的細(xì)胞染色，3級(jí)為＞20%的細(xì)胞染色。②細(xì)胞著色程度：無著色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分；上述2項(xiàng)相加為著色程度積分，染色總評(píng)分表示白介素在皮膚組織中表達(dá)的強(qiáng)弱。結(jié)果：0，1為陰性；2為弱陽性（+）；3為陽性（2+）；4及>4為強(qiáng)陽性（3+），弱陽性及以上視為陽性表達(dá)。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因子分析的非成對(duì)t檢驗(yàn)（等方差雙尾檢驗(yàn)）以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理變化 治療結(jié)束時(shí)，C組小鼠皮損區(qū)仍表現(xiàn)為鱗狀上皮增生明顯，表皮可見5～6層角質(zhì)形成細(xì)胞，局部呈乳頭狀增生，真皮淺層血管周圍可見少量炎性細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張、充血，小鼠皮損區(qū)表皮平均厚度（105.50±18.43）μm，見圖 1A；而 A組，見圖1B和B組，見圖1C，小鼠表皮較C組小鼠皮損區(qū)明顯變薄。與C組相比，A組小鼠表皮平均厚度為（67.35±11.50）μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.566，P<0.01）；B 組表皮平均厚度（29.01±6.88 μm），同樣差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.718，P<0.01）。B組表皮厚度改善程度優(yōu)于A組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.797，P<0.01），見圖 2。

圖1A 治療結(jié)束時(shí)C組表皮（HE染色×200）

圖1B：治療結(jié)束時(shí)A組表皮（HE 染色×200）

圖1C：治療結(jié)束時(shí)B組表皮（HE染色×200）

圖2 治療結(jié)束時(shí)3組小鼠表皮厚度差異比較

2.2 免疫組化染色結(jié)果 IL-2、IL-9、IL-10和IL-17陽性表達(dá)主要是指小鼠表皮全層的角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮淺層浸潤的淋巴細(xì)胞胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。

2.2.1 各組小鼠皮損區(qū)IL-2和IL-9的表達(dá)情況 IL-2陽性表達(dá)：C組4只弱陽性，1只陽性，其余5只均為陰性；A組和B組則均有9只小鼠陽性，僅1只為陰性。結(jié)果顯示，A組和B組小鼠皮損區(qū)IL-2的表達(dá)水平均明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均F=1.455，P<0.05）。A組和B組之間小鼠皮損區(qū)IL-2表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.0000，P=1.000 0）。A組小鼠皮損IL-2陽性與陰性表達(dá)見圖 3A、B。

圖3 A組小鼠IL-2和IL-9免疫組化染色模式（×200）

IL-9陽性表達(dá)：C組10只小鼠均為陽性；而A組和B組各有8只陽性，2只陰性表達(dá)。A組和B組小鼠皮損區(qū)IL-9表達(dá)水平均低于C組（F=1.408，P<0.05 和 F=1.225，P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而A組和B組之間小鼠皮損區(qū)IL-9表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.725，P=0.777 1）。A組小鼠皮損IL-9陽性與陰性表達(dá)見圖3C、D。治療結(jié)束時(shí)3組小鼠皮損區(qū)IL-2和IL-9的表達(dá)水平，見表1。

表1 治療結(jié)束時(shí)3組小鼠皮損區(qū)IL-2和IL-9表達(dá)水平 例

2.2.2 各組小鼠皮損區(qū)IL-10和IL-17的表達(dá)情況IL-10陽性表達(dá)：C組6只小鼠為弱陽性，4只為陰性；A組和B組則均有9只小鼠陽性表達(dá)，各僅1只陰性。A組和B組小鼠皮損區(qū)IL-10的表達(dá)水平均明顯高于C組，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.542，2.667，均P<0.05），而A組和B組之間小鼠皮損區(qū)IL-10表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.328，P=0.808 6）。A組小鼠皮損IL-10陽性與陰性表達(dá)見圖 4A、B。

IL-17陽性表達(dá)：C組9只小鼠陽性，1只陰性；A組5只陽性，B組6只小鼠陽性，其陽性程度也有差異，明顯低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.459，1.589，均P＜0.01），而A組和B組小鼠皮損 區(qū)之間IL-17的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.08，P=0.784 7）。A組小鼠皮損IL-17陽性與陰性表達(dá)見圖4C、D。治療結(jié)束時(shí)3組小鼠皮損區(qū)IL-10和IL-17表達(dá)水平，見表2。

圖4 A組小鼠IL-10和IL-17免疫組化染色模式（×200）

表2 治療結(jié)束時(shí)3組小鼠IL-10和IL-17表達(dá)水平 例

3 討論

如何提高濕疹的臨床療效、抑制復(fù)發(fā)和減少藥物不良反應(yīng)發(fā)生，已經(jīng)成為近年來治療濕疹皮炎的熱點(diǎn)。308 nm準(zhǔn)分子光是一種新型的紫外線光源，其針對(duì)濕疹的治療有確切療效[2]，但具體的作用機(jī)制鮮有報(bào)道。濕疹的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，免疫紊亂與失衡是發(fā)病的主要因素。Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞均參與了濕疹的發(fā)病，并且Th2和Th17細(xì)胞處于濕疹發(fā)病的主導(dǎo)地位[4]。308 nm準(zhǔn)分子光在治療濕疹的過程中對(duì)Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)因子的影響目前尚不完全明確。

本實(shí)驗(yàn)通過308 nm準(zhǔn)分子光對(duì)小鼠濕疹模型進(jìn)行治療，觀察皮損區(qū)表皮的變化情況。結(jié)果表明，308 nm準(zhǔn)分子光可以改善濕疹皮損表皮的厚度。這一結(jié)果證明了308 nm準(zhǔn)分子光在濕疹治療中的臨床意義。臨床上，濕疹尤其是慢性濕疹由于反復(fù)搔抓等因素，往往皮膚增厚、粗糙，導(dǎo)致瘙癢明顯加重，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。308 nm準(zhǔn)分子光通過改善皮損厚度，促進(jìn)皮損恢復(fù)，有利于濕疹癥狀的緩解，因此可以作為治療濕疹的一種有效手段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，B組在相同的時(shí)間內(nèi)，對(duì)小鼠濕疹模型的皮損改善程度優(yōu)于A組。這可能與莫米松的外用除通過降低濕疹皮損中Th2和Th17細(xì)胞因子水平，提高Th1和Treg細(xì)胞因子水平起到治療作用之外，尚可以通過抑制包括內(nèi)被蛋白、絲聚合蛋白原/絲聚合蛋白在內(nèi)的多種重要結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，抑制表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖從而導(dǎo)致表皮變薄[5-6]，達(dá)到治療效果。

本實(shí)驗(yàn)在觀察皮損區(qū)表皮變化的同時(shí)，也進(jìn)一步觀察了皮損中Th細(xì)胞因子的表達(dá)情況。以往研究認(rèn)為濕疹的主要機(jī)制為Th1/Th2平衡失調(diào)，而有效治療后往往表現(xiàn)為Th1/Th2細(xì)胞因子失衡的改善[7]，在發(fā)病機(jī)制上，目前認(rèn)為除了Th1和Th2細(xì)胞外，其他T細(xì)胞亞群包括Th17和Treg細(xì)胞亦參與了濕疹的發(fā)病[8-9]。Th17細(xì)胞通過分泌IL-17等起著促進(jìn)炎性反應(yīng)的作用，參與并誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)[10]。Treg細(xì)胞有抑制炎性反應(yīng)的作用，通過細(xì)胞——細(xì)胞接觸抑制和分泌抑制性細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β、IL-10 而發(fā)揮維持自身免疫耐受功能[4]，濕疹癥狀的加重往往與IL-10水平的降低有關(guān)[11]。IL-10作為Treg細(xì)胞分泌的抑制性細(xì)胞因子，不僅可以通過誘導(dǎo)B細(xì)胞向漿細(xì)胞的終末分化從而決定過敏反應(yīng)性，還可通過負(fù)反饋機(jī)制調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡和炎性反應(yīng)[12]。本實(shí)驗(yàn)的免疫組化染色結(jié)果顯示，A組IL-2和IL-10的表達(dá)較C組有不同程度的升高，而IL-9和IL-17表達(dá)水平較C組均有所下降。IL-2、IL-9分別作為Th1和Th2細(xì)胞主要的炎性因子之一，在308 nm準(zhǔn)分子光治療后，其結(jié)果較C組表達(dá)分別為上升和下降，這一變化反應(yīng)了308nm準(zhǔn)分子光的治療對(duì)濕疹皮損Th1/Th2的作用，這與以往的研究顯示有效治療后往往表現(xiàn)為Th1/Th2細(xì)胞因子失衡的改善一致[7]。A組中小鼠皮損區(qū)IL-10表達(dá)水平明顯高于C組，表明308 nm準(zhǔn)分子光照射可以促進(jìn)對(duì)小鼠模型濕疹I(lǐng)L-10的表達(dá)。此外，IL-10可抑制IL-17的產(chǎn)生，從而減輕皮膚的炎性反應(yīng)[11]。IL-17在濕疹的病理生理學(xué)上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，在濕疹的急性期和復(fù)發(fā)期其明顯升高，可能是濕疹的持續(xù)和加劇的因素之一[13]。Leonardi等[14]也觀察到濕疹患兒血清IL-17水平明顯高于健康組，而血清IL-10水平明顯低于健康組這一結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)C組中IL-17高表達(dá)，A組治療后的皮損中IL-17表達(dá)水平明顯下降，表明308 nm準(zhǔn)分子光對(duì)小鼠濕疹模型皮損中IL-17的表達(dá)有明顯抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，莫米松外用治療濕疹在調(diào)節(jié)皮損區(qū)上述4種Th細(xì)胞因子的表達(dá)方面與308 nm準(zhǔn)分子光的治療結(jié)果相一致，二者的作用機(jī)制上有相同之處。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了308 nm準(zhǔn)分子光的治療可減輕濕疹模型的表皮厚度，改善小鼠模型的皮膚損害；同時(shí)可下調(diào)IL-9和IL-17、上調(diào)IL-2和IL-10的表達(dá)，這兩方面均有利于濕疹皮損的轉(zhuǎn)歸。由于濕疹的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，308 nm準(zhǔn)分子光治療后的表皮厚度改善與上述4種細(xì)胞因子表達(dá)的變化是否相關(guān)尚不清楚，有待今后進(jìn)一步研究。