豁痰通絡(luò)方對(duì)大鼠球囊損傷內(nèi)膜增生ERK/JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干預(yù)機(jī)制

沈娟娟 褚穎 蘇穎 胡亞男 聶金娜 路方平 王利鋒 馬金玲 王聞婧 田野

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是中老年人群高發(fā)疾病，介入治療是主要治療方法，但血管成形術(shù)后再狹窄的發(fā)病率不斷增高，危害中老年患者健康，影響其治療遠(yuǎn)期預(yù)后及人們的生活質(zhì)量。血管再狹窄問(wèn)題成為研究心血管領(lǐng)域的難點(diǎn)〔1,2〕。血管再狹窄進(jìn)程中，血管平滑肌細(xì)胞異常增殖，新生內(nèi)膜增厚是主要的環(huán)節(jié)〔3〕。多種因素刺激血管平滑肌細(xì)胞，多種細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)周期，引起血管平滑肌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡。在多種細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，調(diào)節(jié)氨基末端蛋白激酶(JNK)、蛋白激酶(ERK)、p38 絲裂素活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號(hào)通路被激活后，其調(diào)控作用顯著〔4〕。所以干預(yù)血管平滑肌細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為影響經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTCA)后再狹窄防治的重要切入點(diǎn)〔5,6〕。心脈痹阻成為冠心病主要病因病機(jī)，結(jié)合“心主血脈”理論，明確在血管重建術(shù)后再狹窄這個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程中，氣滯、血瘀、痰濁、熱毒四者互結(jié)是其主要的病機(jī)關(guān)鍵〔1〕。根據(jù)“心主血脈”理論，是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)心之氣血陰陽(yáng)，從痰瘀伏絡(luò)，蘊(yùn)結(jié)成毒角度論治血管重建術(shù)后再狹窄，為解決冠心病血管重建術(shù)后再狹窄問(wèn)題提供新思路。本文擬分析豁瘀通絡(luò)方對(duì)大鼠球囊損傷內(nèi)膜增生ERK/JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供SPF級(jí)雄性大鼠60只，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。②實(shí)驗(yàn)試劑：豁痰通絡(luò)方(申請(qǐng)專利，保密)，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)提供，生藥含量2.33 g/ml。辛伐他汀片，遠(yuǎn)大醫(yī)藥中國(guó)有限公司，批號(hào)：H20000107。③實(shí)驗(yàn)器材：水平電泳儀(北京六一有限公司，DYCP-31CN)；數(shù)顯翹板脫色搖床電泳(上海力辰邦西儀器科技有限公司，RS 1)；數(shù)顯臺(tái)式恒溫?fù)u床振蕩器(上海助藍(lán)儀器科技有限公司)〔1〕。

1.2制備模型 SD大鼠術(shù)前皮注低分子肝素鈉抗凝1 h后進(jìn)行造?！?〕。麻醉大鼠后于左頸總動(dòng)脈行球囊損傷術(shù)，術(shù)后給予青霉素及低分子肝素鈉注射液進(jìn)行抗炎、抗凝。假手術(shù)組不進(jìn)行球囊損傷，只結(jié)扎左頸總動(dòng)脈。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠隨機(jī)分為6組，其中假手術(shù)組、模型組給予蒸溜水灌胃，豁痰通絡(luò)組給予1.633 g/ml灌胃；辛伐他汀組給予0.119 mg/ml灌胃；豁痰通絡(luò)+辛伐他汀組給予中藥組方1.633 g/ml、辛伐他汀0.119 mg/ml灌胃，術(shù)后次日灌胃給藥，連續(xù)30 d。以上藥物均按1 ml/kg體重配制給藥。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色法檢測(cè)大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生 將石蠟常規(guī)包埋后，切片烘干常溫保存?zhèn)溆?。采用常?guī)脫蠟、染色、脫水、封片。

1.5免疫組化染色法 根據(jù)免疫組化試劑盒說(shuō)明常規(guī)操作(ERK 抗體效價(jià)1∶100)。免疫組化圖像分析：棕黃色染色為陽(yáng)性反應(yīng)。ERK在胞質(zhì)和胞核中表達(dá)。

1.6RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 取適量標(biāo)本，充分研磨。常規(guī)提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，后進(jìn)行PCR反應(yīng)測(cè)定。白細(xì)胞介素(IL)-1β引物、正義：5′-CTC ATT GTG GCT GTG GAG AA-3′，反義：5′-GGG ATT TTG TCG TTG CTT GT-3′，特異性擴(kuò)增片段為323 bp。IL-6引物：正義：5′-CAC AGA GGA TAC CAC CCA CA-3′，反義：5′-GAA CTC CAG AAG ACC AGA GCA-3′，特異性擴(kuò)增片段為256 bp。β-actin引物，正義：5′-GCC GTC TTC CCC TCC ATC GTG-3′，反義：5′-TAC GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA AC-3′，特異性擴(kuò)增片段為357 bp。PCR條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；IL-1β退火溫度為 55.7℃；IL-6退火溫度為 58.8℃；β-actin退火溫度為60℃，退火30 s； 72℃延伸45 s；72℃最后延伸7 min；共35個(gè)循環(huán)。進(jìn)行凝膠電泳后用AlphaImager EP凝膠成像儀分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照和灰度分析。

1.7Western印跡實(shí)驗(yàn) 取凍存于液氮的血管標(biāo)本，總蛋白提取后采用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定濃度，配制10%分離膠，5%濃縮膠，設(shè)置恒壓80 V，30 min后將電壓設(shè)置為120 V(恒壓)，90 min結(jié)束電泳。轉(zhuǎn)膜設(shè)置恒定電流 400 mA，轉(zhuǎn)膜90 min。采用脫脂奶粉進(jìn)行室溫封閉 120 min，加入一抗，p-ERK、p-p38、p-JNK1/2。25℃水浴箱中震蕩孵育1 h后4 ℃過(guò)夜。二抗孵育按1∶400比例于25℃水浴箱中孵育2 h。應(yīng)用Quaniityone凝膠圖像分析計(jì)算積分光密度，以p-ERK、p-p38、p-JNK1/2蛋白與內(nèi)參照β-actin蛋白積分光密度的比值表示p-ERK、p-p38、p-JNK1/2蛋白的相對(duì)含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1HE染色法檢測(cè)大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生 模型組內(nèi)膜明顯增厚，平滑肌細(xì)胞排列紊亂顯著增生，表明模型已經(jīng)形成；與模型組比較，辛伐他汀組動(dòng)物內(nèi)膜增生顯著緩解，豁痰通絡(luò)組內(nèi)膜增生減輕仍見(jiàn)排列紊亂；豁痰通絡(luò)+辛伐他汀組動(dòng)脈內(nèi)膜增生顯著減輕。見(jiàn)圖1。

2.2免疫組化染色結(jié)果 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)p-ERK表達(dá)，活化后進(jìn)入細(xì)胞核。細(xì)胞核見(jiàn)棕黃色，并見(jiàn)沉積的棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。模型組可見(jiàn)明顯棕黃色細(xì)胞核，豁痰通絡(luò)、辛伐他汀組、豁痰通絡(luò)+辛伐他汀組陽(yáng)性著色與模型組比較顯著改善。見(jiàn)圖2。

圖1 HE法檢測(cè)血管內(nèi)膜增生情況(HE，×100)

圖2 免疫組化染色法檢測(cè)血管ERK蛋白表達(dá)(DAB，×50)

2.3RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與假手術(shù)組比較，IL-1β mRNA表達(dá)在模型組中極顯著增高(P<0.01)，與模型組比較，豁痰通絡(luò)組顯著減少(P<0.05)，辛伐他汀組、豁痰通絡(luò)+辛伐他汀組極顯著減少(P<0.01)，與假手術(shù)組比較，IL-6 mRNA表達(dá)在模型組中極顯著增高(P<0.01)，與模型組比較，豁痰通絡(luò)、辛伐他汀組顯著減少(P<0.05)，豁痰通絡(luò)+辛伐他汀組極顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)表1，圖3，圖4。

表1 各組頸靜脈組織IL-1β、IL-6 mRNA比較

1.假手術(shù)組；2.模型組；3.豁痰通絡(luò)組；4.辛伐他汀組；5.豁痰通絡(luò)+辛伐他汀組；下圖同圖3 RT-PCR檢測(cè)IL-1β mRNA的表達(dá)

圖4 RT-PCR檢測(cè)IL-6 mRNA的表達(dá)

2.4Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)比模型組，豁痰通絡(luò)組、辛伐他汀組均能夠顯著降低p-ERK1/2蛋白表達(dá)(P<0.05)，豁痰通絡(luò)+辛伐他汀組較模型組比較極顯著降低p-ERK1/2蛋白表達(dá)(P<0.01)?；硖低ńj(luò)組、辛伐他汀組、豁痰通絡(luò)+辛伐他汀組較模型組比較均能極顯著降低p-p38、p-JNK1/2蛋白表達(dá)(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表2，圖5。

表2 各組頸靜脈組織ERK1/2、P38、和JNK1/2蛋白表達(dá)比較

圖5 各組ERK1/2、P38、JNK1/2蛋白表達(dá)

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞在正常狀態(tài)下排列緊密連續(xù)，能夠通過(guò)有效抑制脂質(zhì)堆積及炎癥浸潤(rùn)，分泌抗凝血因子，起到抗血栓形成的作用〔8〕，血管成形術(shù)容易損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管內(nèi)膜被撕脫損傷，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞正常功能，出現(xiàn)過(guò)度自我修復(fù)及增殖，減少抗血栓形成因子的分泌，聚集激活血小板后，再次形成血栓〔9〕。經(jīng)血管造影檢測(cè)顯示，多數(shù)患者存在血管再狹窄的風(fēng)險(xiǎn)。

3.1影響血管再狹窄形成的因素 基礎(chǔ)因素：年齡，老年人群為此病證的高發(fā)群體，其血管彈性伴隨著年齡增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，血管內(nèi)皮細(xì)胞失去連貫性，直接影響內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能，再生內(nèi)皮細(xì)胞功能不穩(wěn)定成熟，是血管再狹窄發(fā)生的年齡因素〔10〕。吸煙及肥胖可以加速冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程，也是血管再狹窄發(fā)生的重要影響因素?；A(chǔ)疾病例如糖尿病患者，血糖水平控制不佳直接影響血管再狹窄的發(fā)生發(fā)展〔11〕。炎癥介質(zhì)因素：炎癥細(xì)胞被激活，與血管再狹窄的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)作用，在血管內(nèi)膜被機(jī)械損傷后，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，內(nèi)皮細(xì)胞分泌黏附因子，促使白細(xì)胞被活化，白細(xì)胞聯(lián)合內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)趨化因子及炎癥因子過(guò)度產(chǎn)生，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖，引發(fā)血管重塑，進(jìn)一步促進(jìn)血管在狹窄的發(fā)生〔12〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1及IL-6等細(xì)胞炎癥因子可以和受體結(jié)合，活化細(xì)胞外多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔13〕，例如ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，ERK激活后磷酸化的ERK1/2再激活轉(zhuǎn)錄因子，能夠刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖并遷移，如此產(chǎn)生惡性循環(huán)效應(yīng)，對(duì)血管再狹窄起到重要作用〔14〕。

血管內(nèi)膜被機(jī)械損傷后，內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)一系列變化，其中內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、G蛋白受體、內(nèi)皮面縛因子等活化后刺激細(xì)胞，激活細(xì)胞外多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，釋放血管緊張素-Ⅱ，且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)〔15〕。

例如MAPK家族，其成員主要包括JNK、ERK1/2、p38及ERK5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔16〕。MAPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要存在于細(xì)胞內(nèi)。MAPK可以將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核，把細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，對(duì)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄有非常重要的調(diào)控作用，影響細(xì)胞生長(zhǎng)周期，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖、分化及遷移〔17〕。在MAPK家族中，最為經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為JNK、ERK1/2、p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔18〕。如果受到外界刺激，例如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、滲透壓等因素激活了JNK、ERK1/2、p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使細(xì)胞內(nèi)ERK/JNK的蛋白表達(dá)改變，活化后的ERK由細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核，而JNK活化后將下游底物JNK等磷酸化，活化后的ERK/JNK對(duì)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化、遷移及凋亡等方面有重要的調(diào)節(jié)作用〔19〕。其中JNK對(duì)細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡具有促進(jìn)作用，而ERK1/2可以調(diào)控細(xì)胞的增殖遷移及凋亡，發(fā)揮保護(hù)作用〔20〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，豁痰通絡(luò)方可使內(nèi)膜增生成度顯著降低，并能夠減少頸動(dòng)脈組織中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK1/2的蛋白表達(dá)。闡明中藥豁痰通絡(luò)飲能夠減少球囊損傷后大鼠頸動(dòng)脈血管炎癥反應(yīng)，抑制血管內(nèi)皮增生?？赡芘c抑制 ERK1/2、p38、JNK1/2信號(hào)通路相關(guān)。

3.2中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)識(shí)血管再狹窄 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“心痛”“胸痹”等病證可以概括冠心病、心絞痛的理論范疇，其“心脈閉阻不通”是發(fā)病的重要機(jī)制〔21〕。中醫(yī)認(rèn)為“術(shù)后必傷氣”、“術(shù)后必有瘀”〔22〕。氣為血之帥，血為氣之母，氣虛無(wú)力推動(dòng)血的運(yùn)行，血行不暢，無(wú)力滋養(yǎng)人體，且日久易出現(xiàn)氣滯血瘀，瘀血內(nèi)阻，氣機(jī)被阻滯，失于條達(dá)；進(jìn)而影響津液輸布，津液停聚成痰，痰濕阻滯氣血運(yùn)行，日久蘊(yùn)結(jié)成為熱毒。血管重建術(shù)是現(xiàn)今西醫(yī)普遍應(yīng)用的冠心病、心肌梗死的急救方案。因血管重建術(shù)會(huì)損傷血管內(nèi)皮，形成血栓〔23〕，再次形成瘀血。瘀血阻遏氣機(jī)運(yùn)行，不能化氣行水，津液內(nèi)停形成痰飲，痰濕日久蘊(yùn)結(jié)成為熱毒。形成了氣滯、血瘀、痰濁、熱毒，四者又互為因果，久留不去，伏藏與人體臟腑中，若有內(nèi)外因素干擾，必至血脈再次瘀阻〔24〕。

以上理論均體現(xiàn)伏邪致病的特點(diǎn)，伏邪潛藏于人體臟腑內(nèi)，若人體正氣充足，則不易體現(xiàn)〔25〕。血管重建術(shù)后患者大都病程較長(zhǎng)，人體正氣已經(jīng)虧虛，如若收到內(nèi)外因素干擾，例如感受四時(shí)不正之氣，或情志刺激，勞倦過(guò)度，飲食失節(jié)等因素干擾，則易新感引動(dòng)伏邪，必再次發(fā)病，并且病情進(jìn)一步加重。