基于水分活度測(cè)定的發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁細(xì)菌檢測(cè)方法

楊曉莉 李翠 謝毓華 繩金房

摘要：目的：從水分活度測(cè)定以及影響水分活度的關(guān)鍵限值（溫度和pH）出發(fā)，研究發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁細(xì)菌生長(zhǎng)情況。方法：選取山東綠維胡蘿卜濃縮汁，由該發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁剝離提純的萄球菌、銅綠假單細(xì)胞菌、大腸埃希氏菌、腐生酵母菌，用1mol/L的鹽酸和氫氧化鈉對(duì)胡蘿卜濃縮汁的酸堿度進(jìn)行調(diào)整，以80%的甘油溶液調(diào)整水分活度，測(cè)定細(xì)菌最大生長(zhǎng)率、生長(zhǎng)遲滯時(shí)間、細(xì)菌生長(zhǎng)條件理論最低值以及細(xì)菌生存概率。結(jié)果：水分活度，以及影響水分活度的溫度和pH兩個(gè)關(guān)鍵限值，都是細(xì)菌滋生的必要條件，當(dāng)溫度設(shè)置在37℃時(shí)，隨著水分活度的不斷增加，以及影響水分活度的關(guān)鍵限值pH值增加，發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁的葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單細(xì)胞菌的逐漸增加，生長(zhǎng)速率呈上升趨勢(shì)，3種細(xì)菌的最低水分活度是097，水分活度的最低溫度以及最低pH值分別是453℃和393;影響發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁風(fēng)味的腐生酵母菌隨著水分活度的不斷升高，最大生長(zhǎng)率不斷提升，遲滯時(shí)間逐漸縮短。結(jié)論：水分活度，以及影響水分活度的關(guān)鍵限值溫度和pH值在細(xì)菌滋生的時(shí)候相互作用，水分活度越高，影響水分活度的關(guān)鍵限值溫度和pH越高，發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁細(xì)菌的生長(zhǎng)速率越快，存活率越好。

關(guān)鍵詞：水分活度;細(xì)菌;檢測(cè);生長(zhǎng)速率;遲滯時(shí)間;生存概率

由乳酸菌制成的發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁營(yíng)養(yǎng)含量高，能夠更好地調(diào)節(jié)人體免疫功能[13]。發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁在出廠前都會(huì)在不破壞液體原有菌落的基礎(chǔ)上進(jìn)行非熱殺菌處理，但是此種殺菌技術(shù)效果并不好，在其他環(huán)節(jié)如果控制不當(dāng)，很容易滋生細(xì)菌。水分活度已經(jīng)被發(fā)達(dá)國(guó)家廣泛應(yīng)用于食品范疇內(nèi)，長(zhǎng)期研究表明，水分活度數(shù)值與細(xì)菌繁殖數(shù)量有對(duì)應(yīng)關(guān)系，是延長(zhǎng)貨架期反映食品腐敗性的關(guān)鍵參數(shù)[45]。研究人員通過(guò)研究水分活度的關(guān)鍵限值對(duì)應(yīng)的各微生物生長(zhǎng)發(fā)育情況[68]，得到細(xì)菌繁殖的速度受到水分活度影響。因此，本研究從水分活度以及影響水分活度的關(guān)鍵限值（溫度和pH）出發(fā)，對(duì)發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁細(xì)菌檢測(cè)進(jìn)行研究。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)菌株

選取山東綠維胡蘿卜濃縮汁，市場(chǎng)售賣直投式發(fā)酵劑，乳酸菌菌種。用1mol/L的鹽酸和氫氧化鈉對(duì)胡蘿卜濃縮汁的酸堿度進(jìn)行調(diào)整，以80%的甘油溶液調(diào)整水分活度。將由發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁剝離提純并經(jīng)過(guò)VITEK2 Compact鑒定的葡萄球菌、銅綠假單細(xì)胞菌、大腸埃希氏菌、腐生酵母菌，培養(yǎng)于蛋白胨肉湯斜面培養(yǎng)基，貯藏于冰箱內(nèi)設(shè)置溫度為4℃，為保持活力，每月傳代1次。

12儀器及試劑

萊希特水分測(cè)試儀，深圳市萊希特科技有限公司;TS130酸度計(jì)，鄭州凱達(dá)環(huán)?？萍加邢薰?UV1902PC分光光度儀，上哈奧析科學(xué)儀器有限公司;甘油，山東魯里亞新材料公司。

13方法

131細(xì)菌生存概率測(cè)定在盛有水分活度和pH已經(jīng)調(diào)整過(guò)的9mL發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁的試管中滴入1mL經(jīng)過(guò)發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁稀釋過(guò)的細(xì)菌培養(yǎng)液，此時(shí)菌液濃度為502*103CFU/mL，設(shè)定不同溫度培養(yǎng)48h，進(jìn)行吸光度值測(cè)定，假如發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁經(jīng)增菌液培養(yǎng)前后的吸光度值差值小于0002（±0002是分光光度計(jì)下的相對(duì)誤差范圍），那么這些細(xì)菌就能生存，如果沒(méi)有明顯差別，那么這些細(xì)菌就不能生存（以2值變量0表示）。

132細(xì)菌生長(zhǎng)條件理論最低值和生長(zhǎng)遲滯時(shí)間確定模型處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，微生物的整體發(fā)育如同化學(xué)反應(yīng)時(shí)的一級(jí)催化反應(yīng)，具體為某時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量（或質(zhì)量）與細(xì)胞數(shù)量（或菌體質(zhì)量）的增長(zhǎng)速率的比是常數(shù)。當(dāng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)為t0時(shí)，測(cè)出的細(xì)胞數(shù)目是N0;當(dāng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)為t時(shí)，測(cè)出的細(xì)胞數(shù)目是Nt，通過(guò)式（1）可得出培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)速率常數(shù)為μ。

μ=（1gNt-1gN0）tt0*2 303（1）

設(shè)定生長(zhǎng)溫度最低值為T(mén)min，在pH 65、水分活度為099時(shí)，培養(yǎng)基中的5種不同細(xì)菌在不同溫度條件下的生長(zhǎng)速率，采用SPSS V260軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，Ratkowsky模型參數(shù)在使用迭代計(jì)算時(shí)會(huì)運(yùn)用LevenbrrgMarquardt過(guò)程，從而得出式（2）：

μmax=b（TTmin）{1exp[cTTmax）]}（2）

式（2）中，細(xì)菌最高生長(zhǎng)速度為μmax，細(xì)菌理論最高生長(zhǎng)溫度為T(mén)max，最低生長(zhǎng)溫度為T(mén)min，，模型參數(shù)分別為b和c。最低水分活度和pH值分別為Awmin和pHmin，細(xì)菌最大生長(zhǎng)率，修正公式如式（3）：

μmax=a（AwAwmin）*（pHpHmin）*（TTmin）2（3）

導(dǎo)入SPSS V260軟件，Ratkowsky模型參數(shù)在使用迭代計(jì)算時(shí)會(huì)運(yùn)用LevenbrrgMarquardt過(guò)程迭代計(jì)算[9]，得出pH理論最低值和限制微生物生長(zhǎng)的水分活度分別為T(mén)min和pHmin。

生長(zhǎng)遲滯時(shí)間為式（4），其中模型系數(shù)分別為a和d。

λ=d*（AwAwmin）*（pHpHmin）*（TTmin）2 （4）

式（4）中，Awmin是限制細(xì)菌生長(zhǎng)的水分活度，pHmin是pH的理論最低值，Tmin是溫度理論最低值。應(yīng)用響應(yīng)面模型，最大生長(zhǎng)速率為式（5），生長(zhǎng)遲滯期為式（6）。

μm=Iμ+m1T+m2pH+m3Aw+m4T2+m5pH2+m6A2w+m7TpH+m8TAw+m9pHAw （5）

λm=Iλ+l1T+l2pH+l3Aw+l4T2+l5pH2+l6A2w+l7TpH+l8TAw+l9pHAw

（6）

式（5）～（6）中，模型常數(shù)分別為Iμ和Iλ，模型系數(shù)分別為m19和l19。

2結(jié)果與分析

21葡萄球菌、銅綠假單細(xì)胞菌、大腸埃希氏菌生存概率

觀察發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁的葡萄球菌、銅綠假單細(xì)胞菌、大腸埃希氏菌生存概率、水分活度對(duì)細(xì)菌繁殖的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用三因素五水平CCD方案，參照水分活度范圍、發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁的儲(chǔ)藏溫度以及限制細(xì)菌生長(zhǎng)條件最低值等因素。當(dāng)水分活度較低，同時(shí)影響水分活度的溫度和pH兩個(gè)關(guān)鍵限值都較低的情況下，3種發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁細(xì)菌的生存概率也較低，從表1可看出，當(dāng)水分活度為096，同時(shí)影響水分活度的溫度僅為10℃、pH為46時(shí)，葡萄球菌、大腸埃希氏菌及銅綠假單細(xì)胞菌生存概率幾乎為0;當(dāng)水分活度為0963，影響水分活度的溫度為26℃、pH為46時(shí)，細(xì)菌生存概率為100%。由此可見(jiàn)，水分活度，以及影響水分活度性能的兩個(gè)關(guān)鍵限值溫度以及pH相互作用相互影響，是細(xì)菌滋生的必要條件（表1）。

22不同水分活度下細(xì)菌生長(zhǎng)速率

從表2可以看出，當(dāng)溫度設(shè)置在37℃，在不同水分活度以及不同影響水分活度的pH情況下，發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁3種細(xì)菌的生長(zhǎng)速率受到不同影響。隨著pH值與水分活度的不斷增加，3種細(xì)菌的生長(zhǎng)速率逐漸升高。將通過(guò)表2得出的生長(zhǎng)速率數(shù)值與已知的最低生長(zhǎng)溫度理論值Tmin帶入式（3），得到發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁3種細(xì)菌存活的最低水分活度、最適宜溫度和最低pH。從表3可以看出，發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁3種細(xì)菌的存活最低水分活度都為093左右;葡萄球菌及大腸埃希氏菌的最低存活溫度分別為831、761℃，而銅綠假單細(xì)胞菌無(wú)論是最低溫度還是最低pH值都低于另兩種細(xì)菌，說(shuō)明要確保3種細(xì)菌的出現(xiàn)，最大水分活度要保證為097，同時(shí)要確保影響細(xì)菌水分活度的溫度最低為453℃、pH最低為393。在試驗(yàn)中，銅綠假單細(xì)胞菌的最低水分活度較高，而大腸埃希氏菌和葡萄球菌的最低水分活度較低，原因是此實(shí)驗(yàn)以甘油作為水分活度調(diào)節(jié)劑，甘油更易滲入細(xì)胞內(nèi)部，降低細(xì)胞內(nèi)水分活度更快，對(duì)細(xì)胞器及大分子物質(zhì)起到保護(hù)作用。

23腐生酵母菌最大生長(zhǎng)速率和遲滯時(shí)間

發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁中的腐生酵母菌是影響發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁風(fēng)味的主要微生物之一。如果水分活度，以及影響水分活度的溫度和pH等條件合理，腐生酵母菌就會(huì)批量繁殖，產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物。腐生酵母菌是一種腐敗菌極易使發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁腐化變質(zhì)腐，測(cè)試其在24℃情況下，不同水分活度以及不同影響水分活度的pH情況下的生長(zhǎng)速率。分析表4可得，在24℃時(shí)，不同水分活度以及不同影響水分活度的pH條件下，測(cè)得的發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁的腐生酵母菌最大生長(zhǎng)速率和遲滯時(shí)間有所不同，隨著水分活度和pH的不斷升高，腐生酵母菌的最大生長(zhǎng)率不斷提升，而遲滯時(shí)間逐漸縮短。

3討論

水分活度一般指自由水，每種微生物滋生所需的最低水分活度不同[1012]。

本研究顯示，當(dāng)水分活度逐漸提高，且影響水分活度性能的溫度和pH逐漸提高，則發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁的葡萄球菌、銅綠假單細(xì)胞菌、大腸埃希氏菌、腐生酵母菌細(xì)菌生長(zhǎng)情況越好。在水分活度為099時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)速率最快。其中，葡萄球菌的最低生存值為溫度831℃、

pH 421、水分活度0937;銅綠假單細(xì)胞菌的最低生存值為溫度453℃、pH 421、水分活度094;大腸埃希氏菌最低生存值為溫度761℃、pH 414、水分活度0937。由此可知，如果發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁的水分活度低于093、pH低于39、所處環(huán)境溫度低于4℃，以上3種細(xì)菌將很難成活。且本研究發(fā)現(xiàn)，要確保3種細(xì)菌的出現(xiàn)，最大水分活度要保證為097，同時(shí)要確保影響細(xì)菌水分活度的溫度最低為453℃、pH最低為393。

水分活度和pH越大，發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁腐生酵母菌的最大生長(zhǎng)率越快，遲滯時(shí)間越短。臨界條件下，發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁中的大腸埃希氏菌、葡萄球菌和銅綠假單細(xì)胞菌在不同水分活度、溫度和pH間具有相互作用，從本研究數(shù)據(jù)中可以看出，水分活度與pH、溫度在細(xì)菌的生存極限影響中相互作用[1314]，假如細(xì)菌的生存溫度逐漸降低，在水分活度和pH條件較高的情況下，細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制，由此可見(jiàn)，發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁要盡量貯存于低溫環(huán)境[15];如果將水分活度和pH條件降低，那么溫度可以相對(duì)升高，發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁就可以常溫保存了，這樣不但節(jié)約了貯存和運(yùn)輸成本，也降低了能源消耗。

4結(jié)論

本研究從水分活度測(cè)定出發(fā)，構(gòu)建發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁細(xì)菌生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)概率模型，通過(guò)水分活度以及影響水分活度的兩個(gè)關(guān)鍵限值溫度和pH，檢測(cè)發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)情況，研究發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁的葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單細(xì)胞菌的生成概率和生長(zhǎng)速率，以及腐生酵母菌的最大生長(zhǎng)概率以及遲滯時(shí)間，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵胡蘿卜濃縮汁各種細(xì)菌的生存概率，同水分活度以及影響水分活度的兩個(gè)關(guān)鍵限值溫度和pH影響，溫度和水分活度越高，細(xì)菌生存概率越高?！?/p>

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