宏基因二代測序技術(shù)對醫(yī)院傳染性疾病防控的價值

林佳冰， 高曉東*， 胡必杰,2*， 陳 翔

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感染病科，上海 200032

醫(yī)院感染是指住院病人在醫(yī)院內(nèi)獲得的感染，包括在住院期間發(fā)生的感染和在醫(yī)院內(nèi)獲得、出院后發(fā)生的感染，但不包括入院前已開始或入院時已處于潛伏期的感染。醫(yī)院工作人員在醫(yī)院內(nèi)獲得的感染也屬醫(yī)院感染[1]。而傳染性疾病較其他易發(fā)生院內(nèi)感染的疾病而言，危害性更大。住院患者免疫力低下，易受感染，同時大量患者需進行氣管插管、導(dǎo)尿管或中心靜脈置管等感染高風(fēng)險操作，一旦發(fā)生傳染性疾病的院內(nèi)傳播，將帶來巨大不良影響。因此，對醫(yī)院內(nèi)傳染性疾病患者進行早期診斷并采取針對性的防控措施，對防止傳染性疾病的院內(nèi)傳播與暴發(fā)，具有重要意義。

近年來，隨著宏基因二代測序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技術(shù)在感染性疾病領(lǐng)域研究的不斷深入，基于mNGS的分子遺傳學(xué)檢測在感染性疾病中的診斷價值已逐漸被認識，mNGS已在多個領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[1]，如多種疾病的早期診治、遺傳學(xué)和微生物檢測等。但mNGS在醫(yī)院感染防控中的作用報道較少，因此，認識mNGS在傳染性疾病的早期識別與診斷中的重要作用，對醫(yī)院感染防控早期干預(yù)意義重大。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2018年1月1日至2019年12月31日復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的5例傳染性疾病患者病例資料，包括一般資料、mNGS結(jié)果、常規(guī)微生物培養(yǎng)結(jié)果和醫(yī)院感染防控相關(guān)干預(yù)措施等。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(No.B2017-193R)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

納入標準：(1)患者住院期間行mNGS檢測；(2)mNGS結(jié)果為傳染性疾病，且其傳播可能會導(dǎo)致嚴重后果；(3)mNGS的標本質(zhì)量合格，標本檢測過程中質(zhì)控合格，結(jié)果可靠。排除標準：(1)患者住院期間未行mNGS；(2)mNGS結(jié)果為非傳染性疾病，或為傳染性疾病，但其傳播不會引起嚴重公共衛(wèi)生事件；(3)mNGS過程中出現(xiàn)質(zhì)控不合格。

1.3 mNGS (1)樣本處理與核酸提?。喝獦吮救?～4 mL，預(yù)先離心后取上清液；除血以外標本取0.5～3 mL。然后各類型標本中加入玻璃珠混合震蕩，采用TIANamp Micro DNA Kit(DP315,TIANGEN BIOTECH)試劑盒進行樣本DNA提取。(2)構(gòu)建文庫：采用Agilent 2100 Bio-analyzer和定量PCR進行DNA文庫質(zhì)控，文庫經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)后，滾環(huán)復(fù)制形成DNB納米球備用。(3)測序：將DNB納米球加載到測序芯片，采用BGISEQ-500(華大基因，中國)進行測序，根據(jù)測序結(jié)果剔除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，比對微生物大數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)，將測序結(jié)果按照病毒、細菌、真菌和寄生蟲等進行分類排列。

1.4 概念標準 (1)醫(yī)院感染：對患者出院后該病區(qū)患者、醫(yī)務(wù)人員及其他密切接觸者隨訪30 d，觀察是否出現(xiàn)新發(fā)相似感染癥狀人員，判斷是否發(fā)生院內(nèi)傳播。(2)標準預(yù)防：針對所有病人的預(yù)防性措施，認定病人的血液、體液、分泌物、排泄物、損傷的皮膚、黏膜和被這些物質(zhì)污染的物品具有潛在感染而采取的標準水平消毒、隔離等預(yù)防措施。無論患者是否確診或疑似感染，都要采取標準預(yù)防。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 結(jié)果(表1)顯示：5例患者納入本研究，均為男性，平均年齡為45.4歲。3例患者以發(fā)熱為主訴，1例以右上肢皮膚腫脹伴破潰流膿5 d為主訴，1例以左頸部搏動性包塊1月余為主訴。5例患者中，有蟲咬史1例，有瘧疾感染史2例。

表1 5例傳染性疾病患者一般資料分析

2.2 mNGS和常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果比較 結(jié)果(表2)顯示：5例患者常規(guī)微生物培養(yǎng)均為陰性，mNGS結(jié)果：炭疽芽孢桿菌1例，霍亂弧菌1例，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群1例，三日瘧原蟲1例，惡性瘧原蟲1例。

2.2.1 患者A確診過程 2019年5月28日，送引流液行常規(guī)微生物培養(yǎng)，同時采集血標本送檢mNGS。5月30日mNGS結(jié)果為炭疽芽孢桿菌，5月30日回報微生物培養(yǎng)結(jié)果為陰性。追問病史：患者于2019年5月初有著短袖搬運死牛史，隨后出現(xiàn)右前臂傷口，結(jié)合mNGS結(jié)果及病史，初步確診炭疽。后續(xù)患者被轉(zhuǎn)至上海市公共衛(wèi)生中心，期間通過PCR進一步確診炭疽。

表2 5例患者mNGS和常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果比較

2.2.2 患者B確診過程 2019年8月21日采集傷口拭子標本送檢mNGS，8月23日結(jié)果為霍亂弧菌。8月28日送檢皮膚膿液及血行微生物培養(yǎng)，8月30日回報結(jié)果均為陰性。9月2號采集血標本送檢mNGS，9月4日結(jié)果依然顯示霍亂弧菌，檢出大量唯一匹配的霍亂弧菌序列數(shù)，檢出結(jié)果明確，且患者為慢性肝病患者，考慮非O1/O139霍亂弧菌引起的皮膚軟組織感染。

2.2.3 患者C確診過程 2019年11月15日行痰涂片找抗酸桿菌和痰分枝桿菌培養(yǎng)，11月17日回報結(jié)果均為陰性。2019年12月18日采集痰標本送檢mNGS，12月20日結(jié)果顯示：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。12月20日結(jié)核菌感染T細胞斑點試驗(T-SPOT)結(jié)果示A/B：24/67?；颊逤入院時未考慮患傳染性疾病，住院過程中出現(xiàn)咳嗽、咳痰現(xiàn)象，但痰培養(yǎng)未見分枝桿菌，后根據(jù)mNGS結(jié)果及T-SPOT結(jié)果，確診結(jié)核。

2.2.4 患者D確診過程 2018年10月17日采集血標本送檢mNGS，10月19日結(jié)果顯示：三日瘧原蟲。10月20日回報血涂片鏡檢找瘧原蟲及進行寄生蟲全套抗體檢測結(jié)果，均為陰性?；颊逥有瘧疾感染史，檢出結(jié)果明確，同時結(jié)合患者此次生病期間發(fā)熱特點及流行病學(xué)史，確診瘧疾。

2.2.5 患者E確診過程 2019年1月7日行血涂片鏡檢找瘧原蟲，結(jié)果陰性，同時采集血標本送檢mNGS，1月9日結(jié)果顯示：惡性瘧原蟲。1月11日經(jīng)中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所檢測后，結(jié)果為瘧疾快速診斷試劑卡顯示抗原陽性，涂片陰性?；颊逧有瘧疾感染史，mNGS檢出結(jié)果明確，結(jié)合其流行病學(xué)史，確診瘧疾。

2.3 醫(yī)院感染防控措施的調(diào)整 結(jié)果(表3)顯示：5例患者入院時醫(yī)院感染防控措施均為標準預(yù)防。根據(jù)mNGS結(jié)果，提早確診傳染性疾病并調(diào)整醫(yī)院感染防控措施，隨訪30 d內(nèi)，未出現(xiàn)院內(nèi)傳播新發(fā)病例。

表3 醫(yī)院感染防控措施的調(diào)整和病例隨訪情況

2.3.1 患者A的防控措施 及時將患者A轉(zhuǎn)入負壓單間病房進行隔離，相關(guān)醫(yī)護人員嚴格進行手衛(wèi)生與口罩防護，對于需要進行密切接觸操作者，要求穿戴隔離衣及防護鞋，必要時佩戴護目鏡或面罩?；颊咚褂冕t(yī)療設(shè)備進行嚴格消毒，加強環(huán)境清潔，患者出院后使用過氧化氫消毒機進行房間的終末消毒。對患者日常所更換被服及出院后的各種床單元用品統(tǒng)一裝入感染性織物袋中進行清潔消毒，規(guī)范處置該患者的醫(yī)療廢物。同時聯(lián)系我院防保科，進行病例上報，并請具有專業(yè)傳染病防控診治的上海市公共衛(wèi)生中心專家會診，會診后轉(zhuǎn)至該中心進一步治療。經(jīng)上述干預(yù)后，隨訪30 d內(nèi)，未出現(xiàn)院內(nèi)傳播的新發(fā)病例。

2.3.2 患者B的防控措施 霍亂通常由產(chǎn)霍亂毒素的O1/O139霍亂弧菌引起，在我國屬于甲類傳染病，但患者B未出現(xiàn)霍亂典型臨床表現(xiàn)——排“米泔樣”便。本患者為乙肝患者，血mNGS及皮膚傷口拭子均提示霍亂弧菌，培養(yǎng)結(jié)果均陰性，考慮非O1/O139霍亂弧菌可能性大，其傳播力較O1/O139霍亂弧菌弱，但仍需重視，因此對該患者加強接觸預(yù)防措施，相關(guān)接觸預(yù)防措施同患者A。同時聯(lián)系我院防保科，進行病例上報。對患者進行針對霍亂弧菌引起的皮膚軟組織感染治療后，患者病情好轉(zhuǎn)出院，且隨訪30 d內(nèi)，未出現(xiàn)院內(nèi)傳播的新發(fā)病例。

2.3.3 患者C的防控措施 及時將該患者轉(zhuǎn)移至單間隔離，醫(yī)務(wù)人員加強個人防護，佩戴醫(yī)用防護口罩，高危操作時佩戴N95口罩，嚴格執(zhí)行手衛(wèi)生，盡量避免家屬探視，加強通風(fēng)。同時請上海市公共衛(wèi)生中心專家進行會診，后續(xù)轉(zhuǎn)至該中心進一步治療。經(jīng)上述干預(yù)后，隨訪30 d內(nèi)，未出現(xiàn)院內(nèi)傳播的新發(fā)病例。

2.3.4 患者D的防控措施 針對患者D，要特別注意防蚊滅蚊，避免蚊蟲帶來傳播，保持病區(qū)干凈衛(wèi)生，注意通風(fēng)。同時給予患者D正規(guī)抗瘧治療，患者好轉(zhuǎn)出院。經(jīng)上述干預(yù)后，隨訪30 d內(nèi)，未出現(xiàn)院內(nèi)傳播的新發(fā)病例。

2.3.5 患者E的防控措施 請上海市公共衛(wèi)生中心感染科會診進行進一步病例確認，調(diào)整后防控措施同患者D，同時給予患者E正規(guī)抗瘧治療，患者好轉(zhuǎn)出院。隨訪30 d內(nèi)，未出現(xiàn)院內(nèi)傳播的新發(fā)病例。

3 討 論

傳染性疾病是由各種病原體引起的，能在人與人、動物與動物或人與動物之間相互傳播的一類疾病。2020年1月20日，國家衛(wèi)生健康委員會將新型冠狀病毒肺炎納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病。中國目前的法定傳染病有甲、乙、丙3類，共40種。其中不乏傳播能力強、致病力強的疾病，故傳染病仍是一個十分重要的公共衛(wèi)生問題[5]。如果不能對其進行早期識別，并給予針對性的防控措施，一旦發(fā)生院內(nèi)傳播，將對醫(yī)院內(nèi)患者造成巨大威脅，甚至形成影響嚴重的公共衛(wèi)生事件。

在醫(yī)院的日常診療工作中，難免需要接觸許多處于潛伏期或傳染期的傳染性疾病患者，同時，醫(yī)院人流量大、交叉感染風(fēng)險高，存在免疫力低下患者等眾多高危人群，傳播環(huán)節(jié)多且不易控制到位。并且許多醫(yī)院，特別是基層醫(yī)院普遍不重視傳染性疾病防控，一旦出現(xiàn)嚴重傳染性疾病暴發(fā)，后果不堪設(shè)想[6]。

目前傳染性疾病的診斷主要依賴常規(guī)微生物培養(yǎng)法[7]。國內(nèi)絕大部分臨床微生物實驗室均采用基于生化反應(yīng)的自動或半自動微生物鑒定系統(tǒng)進行菌種鑒定。MALDI-TOF MS技術(shù)可分離細菌和真菌[8]，但因儀器價格與技術(shù)等原因，目前尚未在基層醫(yī)院廣泛使用。但是，由于標本培養(yǎng)采集不規(guī)范、送檢時機不合理[9]及某些苛養(yǎng)菌常規(guī)方法難以培養(yǎng)等原因，常規(guī)微生物培養(yǎng)常呈現(xiàn)陰性結(jié)果，并且對一些少見、罕見及菌種復(fù)合體的鑒定，結(jié)果也不十分可靠[10-11]。而對病毒、寄生蟲的檢測，常規(guī)醫(yī)院更是難以開展[12]。因此，借助常規(guī)微生物培養(yǎng)結(jié)果鑒別診斷傳染性疾病時，感染控制部門常無法對疾病進行早期、準確地診斷，也就無法及時采取合適的防控措施，嚴重影響了傳染性疾病的防控工作。

mNGS檢測范圍覆蓋細菌、真菌、病毒、寄生蟲，可在病原體未知的情況下尋找病原體，比起傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法，監(jiān)測范圍更廣、靈敏度更高[13]。目前mNGS在醫(yī)院感染方面的應(yīng)用，大多只涉及醫(yī)療機構(gòu)環(huán)境的污染檢測、利用全基因測序?qū)︶t(yī)院感染暴發(fā)進行追蹤及耐藥基因組研究等領(lǐng)域[14-16]，而對醫(yī)院感染防控中很重要的早期干預(yù)的應(yīng)用還較少。mNGS在其他研究中體現(xiàn)出檢出率高、耗時短、精確性強等優(yōu)勢[17-18]，如能應(yīng)用到感染性疾病的早期診斷中，提早對患者進行針對性的干預(yù)措施，做好防護工作，保護高危人群，降低醫(yī)院傳播的風(fēng)險，將會大大提升傳染性疾病的醫(yī)院感染防控工作效果。

本研究結(jié)果顯示，mNGS可有效發(fā)現(xiàn)未知傳染性病原體，快速鑒定疾病病原體，在最短時間內(nèi)準確獲取病原體的全面信息，同時，還可幫助進行傳染性疾病的早期診斷，調(diào)整患者的治療方案，對有效控制傳染性疾病疫情也起到了決定性作用。并且，通過將mNGS的診斷標準進一步標準化、統(tǒng)一化，克服了診斷標準不明確、成本高的缺點[19-20]，使得mNGS在傳染性疾病早期診斷中應(yīng)用更為明確。若將mNGS常規(guī)化，將來可為醫(yī)院感染防控工作做出更大貢獻。

綜上所述，mNGS在傳染性疾病的早期識別與診斷中具有重要作用，可對醫(yī)院感染防控早期干預(yù)起到良好的指導(dǎo)效果。