鄧穎，黎金鳳，陳志雄，王晨秀，胡雅琴，黃水金，劉精東，程宗佑，霍亞南

作者單位：江西省人民醫(yī)院、南昌大學(xué)附屬人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江西 南昌330000

糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起的糖代謝紊亂的內(nèi)分泌綜合征［1-3］。糖尿病可有多種并發(fā)癥，腎、神經(jīng)、心血管、眼等器官的病變已廣為人知，而糖尿病合并骨質(zhì)疏松的發(fā)生率也明顯增加［2，4-5］。1/2 以上的糖尿病病人骨密度降低，1/3病人被診斷為骨質(zhì)疏松［2，4-5］。因此探討糖尿病合并骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制及治療手段意義重大。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）是一種主要由腸道L細胞產(chǎn)生的肽類激素，具有保護胰島β細胞功能，對糖尿病小鼠具有保護作用，也對骨質(zhì)疏松大鼠具有改善作用，從而提示GLP-1 可能對糖尿病合并骨質(zhì)疏松大鼠具有保護作用［6-7］。因此本研究于2018 年8—12月將通過原代培養(yǎng)正常大鼠和2 型糖尿?。═2DM）大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs），并利用GLP-1 干預(yù)BMSCs，探討GLP-1 對糖尿病大鼠BMSCs 成骨及成脂的作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料20 只（200±20）g、4 周齡清潔級的雄性SD大鼠，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002，本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.2實驗試劑與儀器DMEM高糖培養(yǎng)基（gibco公司）；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液（Solarbio 公司）；青鏈霉素混合液（100×）（Solarbio）；成骨誘導(dǎo)液（RASMX-03021-175，cyagen）；成 脂 誘 導(dǎo) A 液（RASMX-03031-175，cyagen）；成 脂 誘 導(dǎo) B 液（RASMX-03032-175，cyagen）；利拉魯肽注射液（諾和力公司）；茜素紅染色試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；GLP-1（7-36）購于美國sigma 公司，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶解制成所需濃度。光學(xué)相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）。

1.3 T2DM大鼠模型復(fù)制將20只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組及T2DM 組，每組10 只，正常組大鼠喂以普通飼料；T2DM 組大鼠喂以高脂飼料（其中含70%碳水化合物、20%蔗糖，10%豬油），每周測定大鼠的體質(zhì)量、飲水量和進食量。于第4 周末大鼠禁食14 h 后，腹腔注射25 mg/kg 鏈脲佐菌素（STZ）溶液（STZ 溶于0.1 mol/L，pH4.5 的檸檬酸緩沖液，配制為1%的溶液），3 d 后測量隨機血糖，血糖低于16.7 mmol/mL 的再次注射STZ 溶液加強模型，隨機血糖連續(xù)2 周均高于16.7 mmol/mL 且出現(xiàn)糖尿病癥狀的大鼠進行后續(xù)實驗。

1.4 BMSCs的分離及培養(yǎng)將SD大鼠缺氧處死，75%乙醇浸泡15～20 min，無菌條件下取下脛骨和肱骨，將其兩端干骺端切除，顯露骨髓腔，用10%完全培養(yǎng)基徹底沖洗骨髓腔，并使骨髓細胞充分分散制成單細胞懸液，離心，棄去上清液，加入DMEM+20%胎牛血清（FBS）+雙抗培養(yǎng)液重懸，分別均勻的鋪在培養(yǎng)板中，并做好標(biāo)記，標(biāo)明代數(shù)，置于37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，3 d換1次液。當(dāng)細胞的融合度達到90%以上時，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗2 次，加入胰蛋白酶消化2～3 min，加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基，將細胞吹打下來并吸取到10 mL離心管中，離心，棄上清，注意不要碰到管口，并接種到新的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 BMSCs的鑒定胰蛋白酶將融合度達到80%～90%的第3 代BMSCs 消化下來并制成單細胞懸液，將細胞濃度調(diào)整為1×106/mL，分于3個已做標(biāo)記的微型離心管（EP管）中，分別加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的CD29、CD34、CD44、CD45單克隆抗體，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌沒有結(jié)合的抗體，最后加入PBS重懸細胞，于流式細胞儀上檢測上述標(biāo)志物的含量。

1.6 BMSCs分組正常大鼠BMSCs（正常組），正常大鼠BMSCs+10 nmol/L GLP-1（正常組+10 nmol/L GLP-1），正常大鼠BMSCs+30 nmol/L GLP-1（正常組+30 nmol/L GLP-1）。T2DM 模型大鼠 BMSCs（模型組），T2DM 模型大鼠 BMSCs+10 nmol/L GLP-1（模型組+10 nmol/L GLP-1），T2DM模型大鼠BMSCs+30 nmol/L GLP-1（模型組+30 nmol/L GLP-1）。

1.7 BMSCs成骨誘導(dǎo)取生長狀態(tài)良好的BMSCs，按 1×10-4個/孔接種至鋪有蓋玻片6 孔板，按照“1.6”分組加入相應(yīng)濃度藥物和成骨誘導(dǎo)液，3 d換1次液，連續(xù)培養(yǎng)21 d 后做堿性磷酸酶（ALP）檢測和茜素紅染色。

1.8 BMSCs成脂誘導(dǎo)取生長狀態(tài)良好的BMSCs，按 1×10-4個/孔接種至鋪有蓋玻片6 孔板，按照“1.6”分組加入相應(yīng)濃度藥物共同培養(yǎng)，成脂誘導(dǎo)液A 液培養(yǎng)3 d 換成脂誘導(dǎo)液B 液誘導(dǎo)1 d，連續(xù)培養(yǎng)14 d后做油紅染色。

1.9 ALP活性檢測在誘導(dǎo)第21 天時候，收集BMSCs，并用不含酶抑制劑的細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，并用BCA 蛋白試劑盒進行定量，最后根據(jù)ALP酶活性試劑盒測定ALP活性。

1.10茜素紅染色在誘導(dǎo)第21天時候，去除培養(yǎng)基，PBS 洗滌細胞玻片，70%乙醇室溫固定細胞，茜素紅染色液覆蓋樣本，37 ℃避光孵育60 min；雙蒸水沖洗玻片3～5 min；熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照后加入10%氯化十六烷基吡啶，室溫30 min，將氯化十六烷基吡啶析出；從每個培養(yǎng)皿取出100 μL溶液加入96 孔板，選擇560 nm 波長進行光密度（OD）值測定，通過樣本總蛋白量對各組OD值進行標(biāo)化。

1.11油紅染色在誘導(dǎo)第14 天，去除培養(yǎng)基，加入4%組織細胞固定液固定15 min；60%異丙醇充分浸潤，油紅染液染色8 min，60%異丙醇快速分化，蘇木素染色2 min，去除染色液，水洗，熒光倒置顯微鏡下觀察，鏡檢結(jié)束后加入100%異丙醇，室溫放置孵育30 min，選擇520 nm波長進行OD值測定。

1.2統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析。觀測資料均為計量資料，用xˉ±s表示，多組比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的鑒定分離獲得的正常組大鼠BMSCs 細胞呈紡錘形或長梭形，核內(nèi)可見1～2 個核仁。同時采用流式細胞術(shù)檢測BMSCs表面標(biāo)志物，結(jié)果正常組及模型組大鼠的BMSCs 表面標(biāo)志物CD29、CD44 陽性率均高于97%，CD34、CD45 陽性率均低于5%，從而說明本實驗獲得的BMSCs均一性較好，純度高，能夠用于后續(xù)實驗。見圖1。

2.2 ALP活性檢測與正常組（2.81±0.04）比較，正常組+10 nmol GLP-1（4.92±0.07）及正常組+30 nmol GLP-1（6.76±0.02）的ALP 活性升高，模型組（3.54±0.09）ALP 活性降低；與模型組比較，模型組+10 nmol GLP-1（5.11±0.10）及模型組+30 nmol GLP-1（5.80±0.17）的ALP活性升高（F＝23.56，P＝0.000）。說明隨著GLP-1 濃度升高，正常組及模型組成骨分化越多。

2.3茜素紅染色結(jié)果與正常組（0.46±0.05）比較，正常組+10 nmol GLP-1（0.53±0.05）及正常組+30 nmol GLP-1（0.64±0.02）的OD值升高，模型組（0.09±0.01）OD 值降低；與模型組比較，模型組+10 nmol GLP-1（0.16±0.03）及模型組+30 nmol GLP-1（0.33±0.03）的OD 值升高（F＝18.39，P＝0.001）。說明隨著GLP-1濃度升高，正常組及模型組成骨分化越多。見圖2。

2.4油紅染色結(jié)果與正常組（0.29±0.05）比較，正常組+10 nmol GLP-1（0.16±0.05）及正常組+30 nmol GLP-1（0.09±0.02）的OD值降低，模型組（0.66±0.01）OD 值升高；與模型組比較，模型組+10 nmol GLP-1（0.43±0.03）及模型組+30 nmol GLP-1（0.34±0.03）的OD 值降低（F＝29.41，P＝0.000）。說明隨著GLP-1濃度升高，可以抑制正常組及模型組的成脂分化。見圖3。

3 討論

糖尿病合并骨質(zhì)疏松作為糖尿病并發(fā)癥在近些年已逐漸得到專家學(xué)者認可，其是一種全身性、代謝性、退行性的骨科疾病，是糖尿病在骨骼系統(tǒng)中的主要并發(fā)癥［5］。病人單位體積的骨量減少，骨強度降低，骨組織微結(jié)構(gòu)改變是糖尿病骨質(zhì)疏松病人主要特征，超過50%的糖尿病病人患有骨質(zhì)疏松。研究顯示不管是1型糖尿?。═1DM）還是T2DM病人均較正常人群發(fā)生髖部骨折的風(fēng)險高［5，8-9］。因此探討糖尿病合并骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制具有重要意義。

BMSCs是一種于1976年發(fā)現(xiàn)，1991年正式命名的間充質(zhì)干細胞。BMSCs 來源于中胚層，能夠從臍帶、骨髓、羊水等多種組織中獲得，并能夠在誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下定向分化為軟骨細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞等，進而修復(fù)受損的細胞［10-12］。BMSCs 由于易分離、易培養(yǎng)，低免疫原性、易轉(zhuǎn)染外源基因及自我更新能力較強，因此被廣泛的應(yīng)用于骨退行性疾病，神經(jīng)退行行疾病，血管病性疾病等疾病的治療中［10-12］。因此本研究首先探討正常大鼠及T2DM大鼠中BMSCs的成骨及成脂分化的影響。原代培養(yǎng)獲得的BMSCs 經(jīng)過流式細胞術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)正常組大鼠及模型組大鼠的BMSCs 表面標(biāo)志物CD29、CD44陽性率均高于97%，CD34、CD45陽性率均低于5%，從而說明本實驗獲得的BMSCs均一性較好，純度高，能夠用于后續(xù)實驗。ALP 是BMSCs 向成骨細胞分化的早期標(biāo)志物之一，在成骨誘導(dǎo)的第3 天就開始表達，是骨鈣素及鈣結(jié)節(jié)形成的前提。本研究ALP 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組BMSCs中ALP 活性低于正常組BMSCs，另外茜素紅染色結(jié)果表明模型組BMSCs 較正常組BMSCs 成骨分化減少，油紅染色結(jié)果表明模型組BMSCs 較正常組BMSCs 成脂分化增加，從而說明糖尿病對BMSCs 的成骨分化具有抑制作用，對BMSCs的成脂分化具有促進作用。

GLP-1是一種主要由腸道L細胞產(chǎn)生的腸促胰島素，具有保護胰島β 細胞，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡的作用［6，13-14］。GLP-1 受體是 G 蛋白偶聯(lián)受體B 家族的一員，能夠廣泛地表達于人及鼠類的胰臟、心臟、肺、腦、胃等組織［6，13-14］。GLP-1 通過結(jié)合于 GLP-1 受體，使自身的 G 蛋白 α 亞基與 β、γ 亞基解離，進而介導(dǎo)細胞內(nèi)不同信號通路，發(fā)揮不同的生理作用［6，13-14］。研究已經(jīng)顯示 BMSCs 表面能夠表達GLP-1受體，GLP-1能夠顯著的促進BMSCs增殖，抑制BMSCs凋亡［15-17］。另外還有研究顯示GLP-1類似物唾液素-4（Exendin-4）能夠促進 BMSCs 向成骨細胞分化，同時還有改善大鼠骨質(zhì)疏松作用［7，18-19］。進而提示GLP-1對骨的保護作用。因此本研究將不同濃度的GLP-1加入到正常組大鼠及T2DM大鼠的BMSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLP-1 不論是對正常大鼠的BMSCs 還是T2DM 大鼠的BMSCs 均具有成骨分化的促進作用，而對成脂分化具有抑制作用。

綜上所述，T2DM 大鼠BMSCs 較正常大鼠BMSCs的成骨轉(zhuǎn)化作用減少，成脂作用增加。GLP-1的加入能顯著的促進T2DM 大鼠BMSCs 及正常大鼠BMSCs的成骨作用，減少成脂作用，從而說明GLP-1對T2DM 大鼠BMSCs 的成骨分化具有促進作用，對成脂分化具有抑制作用。

（本文圖1～3見插圖9-2）

圖1 流式細胞儀檢測各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）表面標(biāo)志物：A為正常組，B為正常組+10 nmol/L胰高血糖素樣肽-1（GLP-1），C為正常組+30 nmol/L GLP-1，D為模型組，E為模型組+10 nmol/L GLP-1，F(xiàn)為模型組+30 nmol/L GLP-1 圖2 各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）成骨分化熒光倒置顯微鏡圖片（茜素紅染色×200）：A為正常組，B為正常組+10 nmol/L胰高血糖素樣肽-1（GLP-1），C為正常組+30 nmol/L GLP-1，D為模型組，E為模型組+10 nmol/L GLP-1，F(xiàn)為模型組+30 nmol/L GLP-1 圖3 各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）成脂分化熒光倒置顯微鏡圖片（油紅○染色×200）：A為正常組，B為正常組+10 nmol/L胰高血糖素樣肽-1（GLP-1），C為正常組+30 nmol/L GLP-1，D為模型組，E為模型組+10 nmol/L GLP-1，F(xiàn)為模型組+30 nmol/L GLP-1