葉晶晶， 張楓琳， 艾　瑋， 朱曉彤， 束　剛， 王麗娜， 高　萍， 江青艷， 王松波

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

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豬BMSCs成脂分化中細(xì)胞膜鈣離子通道、鈣敏感受體及成脂定向相關(guān)基因表達(dá)研究

葉晶晶?， 張楓琳?， 艾瑋， 朱曉彤， 束剛， 王麗娜， 高萍， 江青艷， 王松波

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】研究豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)定向分化為脂肪細(xì)胞過程中細(xì)胞膜上鈣離子通道、鈣敏感受體(Calcium-sensing receptor,CaSR)基因及成脂定向相關(guān)基因的表達(dá)?！痉椒ā繌?～7日齡仔豬骨髓中分離純化出豬BMSCs，誘導(dǎo)豬BMSCs成脂分化。油紅O法和三酰甘油法檢測細(xì)胞分化聚酯狀況。在成脂分化不同時間(0、1、2、5和10 d)收集細(xì)胞，利用熒光定量PCR檢測鋅指蛋白423(Zinc finger protein 423, Zfp423)、脂肪前體細(xì)胞因子(Preadipocyte factor 1, Pref-1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2, BMP2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(Bone morphogenetic protein 4, BMP4)、細(xì)胞膜鈣離子通道及CaSR基因的mRNA表達(dá)變化?！窘Y(jié)果】油紅O染色和三酰甘油檢測結(jié)果表明，成功誘導(dǎo)豬BMSCs成脂分化；定量PCR結(jié)果顯示，在豬BMSCs成脂分化第5天，成脂定向標(biāo)志基因Zfp423、脂肪前體細(xì)胞標(biāo)志基因Pref-1及促進(jìn)成脂分化基因BMP2、BMP4的mRNA相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，說明第5天是豬BMSCs成脂定向形成脂肪前體細(xì)胞的關(guān)鍵時期；同時，細(xì)胞膜上的電壓門控鈣離子通道亞基電壓依賴型α/δ亞型1(Voltage-dependentalpha-2/delta subunit 1, CACNA2D1)、鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1 (Calciumr elease-activated calcium channel modulator 1, Orai1)、瞬時受體電位通道傳統(tǒng)型1(Transient receptor potential canonical type 1,TRPC1)、瞬時受體電位通道M型7(Transient receptor potential melastatin 7,TRPM7)、瞬時受體電位通道香草素受體亞型1(Transient receptor potential vanilloid receptor1,TRPV1)基因和CaSR基因在誘導(dǎo)成脂第5天mRNA相對表達(dá)量也顯著提高(P<0.05)，提示細(xì)胞膜鈣離子通道及CaSR基因可能參與了豬BMSCs成脂分化過程?！窘Y(jié)論】揭示了豬BMSCs成脂分化過程中細(xì)胞膜鈣離子通道、鈣敏感受體及成脂定向相關(guān)基因的表達(dá)模式。

關(guān)鍵詞：豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 鈣離子通道； 鈣敏感受體； 成脂定向； Zfp423基因； BMP基因； Pref-1基因

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有多分化潛能，可分化為脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。豬BMSCs向脂肪細(xì)胞的分化對機(jī)體不同部位(肌內(nèi)、皮下和腹部)的脂肪沉積具有重要調(diào)控作用，進(jìn)而影響豬的胴體品質(zhì)和肉品質(zhì)[1]。鈣離子作為機(jī)體重要的第2信使可參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程，但其是否參與了豬BMSCs成脂分化過程還不清楚。因此，研究豬BMSCs成脂分化中細(xì)胞膜鈣離子通道及受體基因的表達(dá)變化，是后續(xù)研究鈣離子信號調(diào)控豬BMSCs成脂分化的前提。

豬BMSCs成脂分化形成脂肪細(xì)胞包括2個階段：首先是BMSCs成脂定向分化為脂肪前體細(xì)胞，然后是前體脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞[2]。鋅指蛋白423(Zinc finger protein 423,Zfp423)是調(diào)控BMSCs成脂定向的一個關(guān)鍵基因[3]，可促進(jìn)BMSCs成脂定向形成脂肪前體細(xì)胞，而脂肪前體細(xì)胞高表達(dá)其標(biāo)志基因脂肪前體細(xì)胞因子(Preadipocyte factor 1,Pref-1)[4]。此外，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)作為多功能生長因子在脂肪生成中也起著至關(guān)重要的作用[5-6]。

胞外鈣離子可通過細(xì)胞膜上的鈣離子通道和鈣敏感受體(Calcium-sensing receptor,CaSR)來調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度和相關(guān)信號通路，進(jìn)而影響多項細(xì)胞生理功能[7]。細(xì)胞膜上的鈣離子通道包括電壓門控鈣通道(Voltage-gated calcium channel,VGCC)、瞬時受體電位離子通道(Transient receptor potential,TRP)和鈣庫調(diào)控的鈣通道(Store-operated calcium channel,SOC)等。CaSR是細(xì)胞膜上能夠感受胞外鈣離子濃度的G-蛋白偶聯(lián)受體。研究表明，細(xì)胞膜鈣離子通道[8-10]和鈣敏感受體[11]都可參與調(diào)控脂肪前體細(xì)胞的成脂分化。但豬BMSCs成脂分化過程中細(xì)胞膜鈣離子通道和CaSR基因的表達(dá)變化及其作用還不清楚。

因此，本試驗以豬BMSCs為研究對象，研究其成脂分化中不同時間細(xì)胞膜鈣離子通道、CaSR基因以及成脂定向相關(guān)基因(Zfp423、Pref-1和BMP2/4)的表達(dá)，旨在揭示豬BMSCs成脂分化中細(xì)胞膜鈣離子通道及CaSR基因的表達(dá)模式，為后續(xù)進(jìn)一步研究鈣信號在豬BMSCs成脂分化中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

健康的5日齡長白公豬，購于廣州力智農(nóng)業(yè)有限公司。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素和Percoll分離液為Gibco公司產(chǎn)品。辛酸、油酸、地塞米松和胰島素為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2試驗方法

1.2.1豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化及成脂分化選5日齡的長白小公豬，采用紅細(xì)胞裂解法、Percoll密度梯度離心法、差速貼壁法等，從豬骨髓中分離純化出BMSCs，具體分離純化步驟參考我們已建立的方法[12]。取第4代的豬BMSCs，待細(xì)胞生長至匯合度約90%時，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行成脂分化(誘導(dǎo)液：含50 nmol·L-1胰島素、50 nmol·L-1地塞米松、50 μmol·L-1油酸、0.5 mmol·L-1辛酸和含體積分?jǐn)?shù)為5% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基)，細(xì)胞隔天換液，共培養(yǎng)10 d。

1.2.2測定指標(biāo)及方法采用油紅O染色，觀察豬BMSCs成脂分化5、10 d的聚酯情況，并用三酰甘油測定試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的含量。分別于豬BMSCs成脂分化的第0、1、2、5和10天收取細(xì)胞樣品，采用Trizol法抽提細(xì)胞RNA，用Oligo(dT)引物和AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，RT-PCR反應(yīng)體系為SYBR Premix ExTaq，上、下游引物和cDNA模板，以β-actin為內(nèi)參，熒光定量PCR法檢測胞膜鈣離子通道(CACNA2D1、Orai1、TRPC1、TRPM7、TRPV1)和鈣敏感受體(CaSR)基因、成脂定向相關(guān)基因(Zfp423、Pref-1、BMP2、BMP4)的mRNA表達(dá)水平。相關(guān)基因的引物序列見表1。

表1熒光定量PCR所用引物序列

Tab.1Primer sequences used for real-time quantitative PCR

基因GenBank編號序列(5'→3')產(chǎn)物/bpCACNA2D1NM_214183.1F:ACTCCATATTCCCACCGACAT133R:GCCAAACACCTGCCACAAOrai1NM_001173519.1F:GCTGGACACTGACCACGACTA137R:CATTGCTCACCGCCTCGATRPC1NM_001145751.1F:GGAGCCGTTATTGTTGGG191R:ATGATGTTGAAAGGTGGGGTRPM7XM_013993003.1F:GGAGCCGTTATTGTTGGG150R:ATGATGTTGAAAGGTGGGGTRPV1XM_013981216.1F:GGCATTGTGAAGTTCCTGCT111R:CGTGTTGTCAGCCACCTCTACaSRNM_001278748.1F:GTGCCATAGAGGAAATAAACAG198R:CCACGGCGATGGTAGAGPref-1XM_013978448.1F:TGCGTGATGAATGGCTCC110Zfp423R:CAGAAATTGCCCGAAAAGCBMP2XM_013998273.1F:TCAAGGAGAACCACAAGAACA164BMP4R:GTCGCACTGATTACAGGGATAXM_001928029.4F:CGTGGACTTCAGTGATGTGG132R:TGGACGATGGCGTGATTCNM_001101031.2F:CAACAGGCTTTGGGGATAC153R:GAATGACTGGATTGTGGCTCβ-actinXM_003124280.4F:CCACGAAACTACCTTCAACTC131R:TGATCTCCTTCTGCATCCTGT

1.3統(tǒng)計分析

采用Sigmaplot 12.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，不同時間點基因表達(dá)水平比較采用單因素方差分析方法。

2結(jié)果與分析

2.1豬BMSCs的成脂分化

將豬BMSCs分別進(jìn)行成脂誘導(dǎo)5、10 d，用油紅O和三酰甘油試劑盒檢測細(xì)胞聚酯情況。由油紅O染色結(jié)果可知，豬BMSCs第5天開始出現(xiàn)小脂滴，第10天細(xì)胞成脂十分明顯(圖1)；同時三酰甘油檢測結(jié)果顯示，豬BMSCs成脂分化10 d細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的質(zhì)量摩爾濃度顯著高于成脂分化5 d(P< 0.001)(圖2)，以上結(jié)果表明豬BMSCs被成功誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞。

圖1　豬BMSCs成脂分化過程中油紅O染色結(jié)果

Fig.1The oil red O staining result of porcine BMSCs during the adipogenic differentiation

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，***表示差異極顯著(獨立樣本t檢驗分析，P<0.001)。

圖2豬BMSCs成脂分化過程中三酰甘油(TG)質(zhì)量摩爾濃度的變化

Fig.2Triacylglycerol(TG) assay of porcine BMSCs during the adipogenic differentiation

2.2豬BMSCs成脂分化過程中細(xì)胞膜鈣離子通道及CaSR基因mRNA表達(dá)變化

L-型電壓門控鈣離子通道亞基CACNA2D1基因mRNA相對表達(dá)量在豬BMSCs成脂分化前5 d逐漸升高，在第5天達(dá)到最高，并顯著高于(P<0.05)其他時間的相對表達(dá)量，第10天相對表達(dá)量最低(圖3A)。鈣庫調(diào)控的鈣通道Orai1基因mRNA表達(dá)趨勢與CACNA2D1基因類似，第5天相對表達(dá)量顯著高于(P<0.05)其他時間(圖3B)。瞬時受體電位離子通道TRPC1基因mRNA相對表達(dá)量在成脂分化的第2、5天顯著高于(P<0.05)其他時間(圖3C)；TRPM7基因在第5天的mRNA相對表達(dá)量顯著高于(P<0.05)其他時間，第10天mRNA相對表達(dá)量顯著低于(P<0.05)其他時間(圖3D)；TRPV1基因在第2天的mRNA相對表達(dá)量顯著高于(P<0.05)其他時間，同時第5天的相對表達(dá)量也顯著高于(P<0.05)第0、1、10天(圖3E)；鈣敏感受體CaSR基因在成脂分化第5天的mRNA相對表達(dá)量極顯著高于(P<0.01)其他時間(圖3F)。綜上所述，細(xì)胞膜上的鈣離子通道及CaSR基因mRNA表達(dá)都在豬BMSCs成脂分化的第2、5天時有明顯提高。

2.3豬BMSCs成脂分化中成脂定向相關(guān)基因的mRNA表達(dá)變化

在豬BMSCs成脂分化過程中，脂肪前體細(xì)胞標(biāo)志基因Pref-1的mRNA相對表達(dá)量在分化第5天最高，顯著高于(P<0.05)其他時間的mRNA相對表達(dá)量。此外，第6天的mRNA相對表達(dá)量也顯著高于(P<0.05)第0、1、2、8、10天的mRNA相對表達(dá)量(圖4A)。成脂定向標(biāo)志基因Zfp423在成脂分化第2、5天的mRNA相對表達(dá)量顯著高于(P<0.05)其他時間的mRNA相對表達(dá)量(圖4B)；成脂定向關(guān)鍵細(xì)胞因子BMP2和BMP4基因在成脂分化第5天的mRNA相對表達(dá)量最高，且顯著高于(P<0.05)其他時間的mRNA相對表達(dá)量(圖4C、4D)。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同一分圖中不同誘導(dǎo)時間的柱上凡是有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著(單因素方差分析，P> 0.05)。

Fig.3The mRNA expression patterns of calcium channel and CaSR genes in plasma membrane during the adipogenic differentiation of porcine BMSCs

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同一分圖中不同誘導(dǎo)時間柱上凡是有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著(單因素方差分析，P> 0.05)。

Fig.4The mRNA expression patterns of adipogenic determination genes during the adipogenic differentiation of porcine BMSCs

3討論與結(jié)論

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)成脂分化一般包括MSCs成脂定向形成脂肪前體細(xì)胞以及脂肪前體細(xì)胞終末分化為成熟脂肪細(xì)胞2個階段[2]。本試驗中，油紅O染色結(jié)果和三酰甘油檢測結(jié)果顯示，在成脂分化中期(第5天)和末期(第10天)有脂滴形成，且末期細(xì)胞聚酯含量顯著高于中期，說明當(dāng)前誘導(dǎo)體系可成功誘導(dǎo)豬BMSCs成脂分化形成脂肪細(xì)胞，可進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)研究。

為進(jìn)一步研究豬BMSCs成脂分化的不同階段，我們又進(jìn)一步研究了成脂定向相關(guān)基因的表達(dá)，間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂定向分化受到一系列關(guān)鍵因子的調(diào)控[13]。其中，Zfp423基因?qū)τ陂g充質(zhì)干細(xì)胞定向形成脂肪前體細(xì)胞起關(guān)鍵的決定作用[13-14]，本試驗中發(fā)現(xiàn)Zfp423基因在豬BMSCs成脂分化第2、5天時表達(dá)量最高，提示在當(dāng)前成脂誘導(dǎo)體系中，第2～5天是成脂定向的關(guān)鍵階段；同時，大量研究發(fā)現(xiàn)成脂定向關(guān)鍵因子BMP2和BMP4可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2、脂肪前體細(xì)胞系3T3-L1以及豬原代脂肪前體細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞[6, 15-17]。本試驗結(jié)果顯示豬BMSCs成脂分化第5天時，BMP2和BMP4基因mRNA相對表達(dá)量極顯著高于其他時間的相對表達(dá)量，提示其在該時間對成脂定向具有一定作用；此外，研究表明Pref-1基因作為脂肪前體細(xì)胞標(biāo)志基因在脂肪前體細(xì)胞中高度表達(dá)，在成熟脂肪細(xì)胞中表達(dá)量降低[4]，我們的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)Pref-1基因mRNA在第5天的表達(dá)水平最高，在第10天的表達(dá)水平很低，說明分化第5天時豬BMSCs已成脂定向分化為脂肪前體細(xì)胞。以上結(jié)果表明，豬BMSCs成脂分化第5天是研究其成脂定向和終末分化的關(guān)鍵節(jié)點，為進(jìn)一步深入研究其成脂定向和終末分化的機(jī)制提供了前期基礎(chǔ)。

本試驗中，豬BMSCs成脂分化過程中細(xì)胞膜鈣離子通道和CaSR基因的mRNA表達(dá)變化顯示，在成脂分化第5天時，細(xì)胞膜鈣離子通道及CaSR基因的表達(dá)量較高，這與成脂定向相關(guān)基因的表達(dá)變化趨勢一致，提示細(xì)胞膜鈣離子通道和CaSR基因可能參與了豬BMSCs的成脂定向。Sun等[18]發(fā)現(xiàn)，阻斷L-型電壓門控鈣離子通道可促進(jìn)小鼠原代脂肪前體細(xì)胞分化聚酯，提示L-型電壓門控鈣離子通道在脂肪前體細(xì)胞分化中起著重要作用。本試驗中L-型電壓門控鈣離子通道亞基CACNA2D1基因在成脂分化第5天時的高表達(dá)提示其可能參與了豬BMSCs成脂分化過程。研究發(fā)現(xiàn)，在人脂肪前體細(xì)胞中TRPC1、Orai1基因均有表達(dá)，且在人脂肪前體細(xì)胞成脂分化中起著重要的調(diào)控作用[19]，本試驗中豬BMSCs成脂分化第5天時TRPC1、Orai1基因的mRNA表達(dá)量均顯著提高，提示其可能也參與了豬BMSCs的成脂分化。Joo等[20]發(fā)現(xiàn)TRPV1基因在3T3-L1脂肪前體細(xì)胞有表達(dá)，可調(diào)控脂肪前體細(xì)胞的分化，本試驗中TRPV1 基因mRNA在第2、5天的高表達(dá)，提示其可能在豬BMSCs成脂分化過程中起著重要作用。此外，有文章表明，TRPM7基因在3T3-L1脂肪前體細(xì)胞中表達(dá)量很高且可促進(jìn)3T3-L1脂肪前體細(xì)胞的增殖和分化[21]，本試驗中TRPM7基因的mRNA在豬BMSCs成脂分化中的表達(dá)變化也提示其可能發(fā)揮著潛在的重要作用。本試驗中發(fā)現(xiàn)CaSR基因在豬BMSCs成脂分化前5 d表達(dá)量逐漸增加，與我們結(jié)果類似的是，人SW872細(xì)胞系誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞時CaSR基因的表達(dá)量也逐漸增加[22]。以上結(jié)果提示，細(xì)胞膜鈣離子通道和CaSR基因在成脂分化過程中的差異表達(dá)可能參與了豬BMSCs成脂分化的調(diào)節(jié)，其具體作用和機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，在豬BMSCs成脂分化第5天，成脂定向相關(guān)基因(Zfp423、Pref-1、BMP2和BMP4)和細(xì)胞膜鈣離子通道(CACNA2D1、Orai1、TRPC1、TRPM7和TRPV1)以及CaSR基因的mRNA相對表達(dá)量顯著提高，說明了第5天是豬BMSCs成脂定向形成脂肪前體細(xì)胞的關(guān)鍵時期，而細(xì)胞膜鈣離子通道及CaSR基因可能參與了這一過程的調(diào)控。以上結(jié)果揭示了豬BMSCs分化成脂過程中細(xì)胞膜鈣離子通道、鈣敏感受體及成脂定向相關(guān)基因的表達(dá)模式，為后續(xù)研究鈣信號調(diào)控豬BMSCs成脂分化的分子機(jī)制提供了前期基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]DU M, HUANG Y, DAS A K, et al. Meat science and muscle biology symposium: Manipulating mesenchymal progenitor cell differentiation to optimize performance and carcass value of beef cattle[J]. J Anim Sci, 2013, 91(3): 1419-1427.

[2]TANG Q Q, LANE M D. Adipogenesis: From stem cell to adipocyte[J]. Annu Rev Biochem, 2012, 81: 715-736.

[3]WEI S J, ZHANG L F, ZHOU X, et al. Emerging roles of zinc finger proteins in regulating adipogenesis[J]. Cell Mol Life Sci, 2013, 70(23): 4569-4584.

[4]GESTA S, TSENG Y H, KAHN C R. Developmental origin of fat: Tracking obesity to its source[J]. Cell, 2007, 131(2): 242-256.

[5]王松波, 束剛, 朱曉彤,等. 骨形態(tài)發(fā)生蛋白在脂肪生成中的作用[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報, 2009, 25(11): 997-1002.

[6]WANG S, ZHOU G, SHU G, et al. Glucose utilization, lipid metabolism and BMP-Smad signaling pathway of porcine intramuscular preadipocytes compared with subcutaneous preadipocytes[J]. Cell Physiol Biochem, 2013, 31(6): 981-996.

[7]BRINI M, CALI T, OTTOLINI D, et al. Intracellular calcium homeostasis and signaling[J]. Met Ions Life Sci, 2013, 12: 119-168.

[8]BISHNOI M, KONDEPUDI K K, BABOOTA R K, et al. Role of transient receptor potential channels in adipocyte biology[J]. Expert Rev Endocrinol Metabol, 2013, 8(2): 173-182.

[9]GRAHAM S J, BLACK M J, SOBOLOFF J, et al. Stim1, an endoplasmic reticulum Ca2+sensor, negatively regulates 3T3-L1 preadipocyte differentiation[J]. Differentiation, 2009, 77(3): 239-247.

[10]CHEN K H, XU X H, LIU Y, et al. TRPM7 channels regulate proliferation and adipogenesis in 3T3-L1 preadipocytes[J]. J Cell Physiol, 2014, 229(1): 60-67.

[11]VILLARROEL P, REYES M, FUENTES C, et al. Adipogenic effect of calcium sensing receptor activation[J]. Mol Cell Biochem, 2013, 384(1/2): 139-145.

[12]DU M Q, HUANG Y Q, LU N S, et al. Characterization and differentiation into adipocytes and myocytes of porcine bone marrow mesenchymal stem cells[J]. J Integr Agr, 2014, 13(4): 837-848.

[13]CHEN M H, TONG Q. An update on the regulation of adipogenesis[J]. Drug Discov Today，2013, 10(1/2): e15-e19.

[14]GUPTA R K, ARANY Z, SEALE P, et al. Transcriptional control of preadipocyte determination by Zfp423[J]. Nature, 2010, 464(7288):619-623.

[15]謝在春, 陳瓊玉, 楊松海,等. BMP2具有誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成脂肪分化的能力[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報, 2008, 24(2): 142-147.

[16]HUANG H, SONG T J, LI X, et al.BMP signaling pathway is required for commitment of C3H10T12 pluripotent stem cells to the adipocyte lineage[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(31):12670-12675.

[17]HAMMARSTEDT A, HEDJAZIFAR S, JENNDAHL L，et al. WISP2 regulates preadipocyte commitment and PPAR gamma activation by BMP4[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(7): 2563-2568.

[18]SUN C, QI R, WANG L, et al. p38 MAPK regulates calcium signal-mediated lipid accumulation through changing VDR expression in primary preadipocytes of mice[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(3): 3179-3184.

[19]HU R, HE M L, HU H, et al. Characterization of calcium signaling pathways in human preadipocytes[J]. J Cell Physiol, 2009, 220(3): 765-770.

[20]JOO J I, KIM D H, CHOI J W, et al. Proteomic analysis for antiobesity potential of capsaicin on white adipose tissue in rats fed with a high fat diet[J]. J Proteome Res, 2010, 9(6): 2977-2987.

[21]CHEN K H, XU X H, LIU Y, et al. TRPM7 channels regulate proliferation and adipogenesis in 3t3-l1 preadipocytes[J]. J Cell Physiol, 2014, 229(1): 60-67.

[22]HE Y H, HE Y, LIAO X L, et al. The calcium-sensing receptor promotes adipocyte differentiation and adipogenesis through PPAR gamma pathway[J]. Mol Cell Biochem, 2012, 361(1/2): 321-328.

【責(zé)任編輯柴焰】

收稿日期：2016- 01- 27優(yōu)先出版時間：2016- 07- 05

作者簡介：葉晶晶(1988—)，男，碩士研究生，E-mail：542006686@qq.com；張楓琳(1993—)，女，碩士研究生，E-mail：771896317@qq.com；?：對本文貢獻(xiàn)相同；通信作者：王松波(1980—)，男，副教授，博士，E-mail：songbowang@scau.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31372397)；廣東省特支計劃項目(2014TQ01N260)

中圖分類號：S831

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001- 411X(2016)05- 0007- 06

Expression of plasma membrane calcium channel, calcium-sensing receptor and adipogenic determination genes during the adipogenesis of porcine bone marrow mesenchymal stem cells

YE Jingjing?, ZHANG Fenglin?, AI Wei, ZHU Xiaotong, SHU Gang, WANG Lina, GAO Ping, JIANG Qingyan, WANG Songbo

(College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 To investigate the mRNA expression of plasma membrane calcium channel, calcium-sensing receptor (CaSR) and adipogenic determination genes during the adipogenesis of porcine bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).【Method】The porcine BMSCs, isolated and purified from 5-7 d piglet, were induced to adipogenic differentiation. Oil red O staining and triglyceride assay were used to detect the formation of adipocytes. The cells were collected at various time points (0, 1, 2, 5, and 10 d) during the adipogenic differentiation of porcine BMSCs. The mRNA expression patterns of zinc finger protein (Zfp423), preadipocyte factor 1 (Pref-1), bone morphogenetic protein 2 (BMP2), bone morphogenetic protein 4 (BMP4), plasma membrane calcium channel and CaSR genes were detected by real-time quantitative PCR. 【Result】The results of oil red O staining and triglyceride assay indicated that porcine BMSCs were successfully induced to adipogenic differentiation. The findings of real-time quantitative PCR demonstrated that the mRNA expression of Zfp423, Pref-1, BMP2 and BMP4 significantly increased at day 5(P<0.05), suggesting that day 5 is the key time for the adipogenic determination of porcine BMSCs. Meanwhile, the mRNA expression of voltage-dependent alpha-2/delta subunit 1 (CACNA2D1), calcium release-activated calcium channel modulator 1 (Orai1), transient receptor potential canonical type 1 (TRPC1), transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7), transient receptor potential vanilloid receptor 1 (TRPV1) and CaSR also significantly increased at day 5, implying that calcium channels and CaSR gene might be involved in the adipogenesis of porcine BMSCs. 【Conclusion】Our data reveal the expression patterns of plasma membrane calcium channel, CaSR and adipogenic determination genes.

Key words：porcine bone marrow mesenchymal stem cells; calcium channel; calcium-sensing receptor; adipogenic determination; Zfp423 gene； BMP gene； Pref-1 gene

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葉晶晶， 張楓琳， 艾瑋，等.豬BMSCs成脂分化中細(xì)胞膜鈣離子通道、鈣敏感受體及成脂定向相關(guān)基因表達(dá)研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016,37(5):7- 12.