屠鈺 李無雙 朗文成 馬琳 武國華

摘?要?對茶葉中γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）等多種功能性活性物質(zhì)的快速檢測，有利于茶葉資源的開發(fā)和有效利用。本研究建立了一種利用實時直接分析（DART）離子源與三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用快速高效定量分析茶葉中GABA含量的方法，測定了10種茶葉中GABA的含量。結(jié)果表明，不同茶葉中GABA的含量存在較大差異，其中九香翠芽中GABA含量最高，達到227.2 μg/g; 其次是信陽毛尖，含量為161.2 μg/g; 日照綠茶的GABA含量最低，為75.6 μg/g。本方法測得的結(jié)果與2，4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜（HPLC）檢測法有較好的一致性。本方法簡便、高效，為快速篩選具有高含量GABA的茶葉品種提供了一種簡單有效的方法。

關(guān)鍵詞?茶葉; γ-氨基丁酸; 實時; 直接分析; 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜; 高效液相色譜

1?引 言

茶葉是世界三大植物性飲料之一，其中，氨基酸是茶葉中重要的含氮物質(zhì)。茶葉中含有的主要氨基酸包括茶氨酸、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）等[1～3]，這些氨基酸不僅對茶葉的口感、香氣的形成有重要影響，同時也具有一定的保健功能[4～8]。其中，GABA是一種天然的非蛋白質(zhì)氨基酸，也是一種重要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有豐富的生理活性[5]。藥理學研究表明，GABA具有一定的降血壓、降血糖、治療神經(jīng)退行性疾病、抗抑郁、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、促進睡眠、增強記憶力等作用[6～13]。

目前，測定GABA的方法包括放射受體法[14]、氨基酸分析儀法[15]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[16]、液相色譜法[17]、電泳法[18]、比色法[19]等。Syu等[17]采用高效液相色譜（HPLC）法測定了茶葉中的游離氨基酸含量，結(jié)果表明，利用丹磺酰氯作為氨基酸的發(fā)色標記試劑可準確地測定茶葉中氨基酸的含量。湯茶琴等[18]采用紙電泳法測定了茶葉中GABA和谷氨酸含量，結(jié)果表明，GABA和谷氨酸分離效果較好，斑點清晰，洗脫液在520 nm處的吸光度與其濃度的線性關(guān)系良好。范霞等[19]用分光光度法測定了烏龍茶中GABA的含量，結(jié)果表明，利用丙酮和AlCl3能有效去除藤茶中的色素，準確測定藤茶中GABA的含量。但是，目前報道的方法普遍存在操作繁瑣、前處理過程復雜和需要使用有毒有害試劑等問題，如GABA需與顯色劑反應后，才能被檢測器檢測等。因此，建立一種簡單、快速、準確、高效的茶葉中GABA定量分析方法具有重要的現(xiàn)實意義。

實時直接分析（DART）離子源是一種非表面接觸的常壓電離技術(shù)，是目前發(fā)展較成熟的大氣壓電離技術(shù)，也是生化分析中常用的方法[20，21]。該方法的特點是樣品無需復雜的前處理過程，所需優(yōu)化的參數(shù)少，因此大大簡化了實驗步驟，縮短了分析時間; 在開放環(huán)境下進行分析，檢測方便快捷; 利用高能氣體作為電離試劑，無需特定溶劑; 無記憶效應，避免了實驗數(shù)據(jù)之間的相互影響。此外，還具有離子化效率高、抗干擾能力強、靈敏度高等優(yōu)點，因此，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)藥殘留分析等領(lǐng)域得到了廣泛應用[22，23]。同時，DART離子源還可直接對固體、液體和氣體狀態(tài)的物質(zhì)直接進行快速分析[24，25]?；贒ART離子源的以上優(yōu)點，本研究建立了DART-MS法測定不同茶葉中GABA含量的方法，為快速篩選具有高含量GABA的茶葉品種提供了方便快捷的方法。為了驗證本方法的可靠性，將本方法測得的結(jié)果與采用2，4-二硝基氟苯進行柱前衍生化HPLC傳統(tǒng)檢測方法[26]的結(jié)果進行了比較，兩者一致性良好。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

TSQ Quantum Access MAX三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），配DART SVP離子源; 樣品傳動軌道（美國Parker Hannifin公司）; DIP-it Samplers（美國IonSense公司）; 隔膜泵（德國Vacuubrand公司）; GENIUS-NM32LA氮氣發(fā)生器（英國Peak Scientific公司）; Waters Alliance 2695 HPLC（配Waters 2475多波長熒光檢測器）和Empower 2色譜工作站（美國Waters公司）; MS205DU分析天平（瑞士Mettler Toledo精密儀器有限公司）; Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）; Puluerisette14粉碎機（德國Fritsch儀器設(shè)備有限公司）; SHZ-D型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華器設(shè)備有限公司）; KH-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）; WGL-230B電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）; QHZ-98A 全溫振蕩培養(yǎng)箱（太倉華大實驗儀器科技有限公司）。

10種茶葉品種分別為： 金駿眉（福建省南平市武夷山）、祁門紅茶（安徽祁門）、九香翠芽（江蘇宜興）、五洲山綠茶（江蘇鎮(zhèn)江五洲山）、桑葉茶（江蘇鎮(zhèn)江）、茉莉花茶（浙江杭州）、龍井綠茶（浙江杭州）、信陽毛峰（河南信陽）、信陽毛尖（河南信陽）和日照綠茶（江北無公害綠茶基地）。

GABA標準品（≥ 98%，北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司）; NaHCO3、2，4-二硝基氟苯（FDBN）、乙酸鈉、冰醋酸、KH2PO4（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）; 甲醇、四氫呋喃（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）; 高純氬氣、氮氣（純度99.999%，蘇州金宏氣體股份有限公司）。

2.2?樣品制備方法

2.2.1?茶葉樣品預處理?將茶葉晾干，放入電熱鼓風干燥箱中，在80℃下烘干至恒重，用粉碎機粉碎，過40目篩后，于20℃貯藏，備用。

3.4?DART-MS法測定不同茶葉提取液中的 GABA含量

3.4.1?標準曲線?取適量GABA標準儲備液，用超純水稀釋得到一系列濃度梯度的標準溶液，采用DART-MS法進行測定。以GABA的DART-MS峰面積作為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，GABA濃度在2.5～40.0 μg/mL范圍內(nèi)，DART-MS峰面積與濃度之間有很好的線性關(guān)系，標準曲線方程為y=1.36×107x-1.29×107（R2=0.998）。同時，以GABA標準溶液的HPLC峰面積作為縱坐標，溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，GABA濃度在2.0～48.0 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度之間有良好的線性關(guān)系，標準曲線方程為y = 3.87×106x-1.69×106 （R2=0.995）。

3.4.2?DART-MS精密度實驗?分別制備含GABA高（4.03 μg/mL）、中（2.02 μg/mL）、低（1.01 μg/mL）3種濃度的茶葉提取液（信陽毛尖），每種濃度3份，每份進樣8 針，進行DART-MS測定，計算每份 8 針的峰面積平均值，以及 3份平均峰面積的RSD，所得3個濃度水平樣品的結(jié)果的精密度分別為2.1%、3.6%和2.8%，表明DART-MS方法的精密度良好。

3.4.3?HPLC精密度實驗?分別制備含GABA高（3.92 μg/mL）、中（1.96 μg/mL）、低（0.98 μg/mL）3種濃度的茶葉提取液（信陽毛尖），按2.2.5節(jié)的步驟進行衍生化處理，每種濃度3份，計算3份峰面積的RSD，所得3種濃度樣品精密度分別為2.0%、2.6%和2.9%，表明HPLC方法精密度良好。

3.4.4?加標回收實驗?為確保實驗數(shù)據(jù)的準確性和可行性，采用HPLC法和DART-MS法分別進行加標回收實驗。平行取3份茶葉（信陽毛尖）提取液，分別加入 5.00、10.00 和15.00 μg/mL GABA標準溶液，樣品與加入的標準溶液體積相等，結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明，HPLC法測定的樣品加標回收率為91.6%～103.2%; DART-MS法樣品加標回收率在85.4%～98.7%范圍內(nèi)，表明DART-MS測定茶葉中GABA的回收率較好，可用于實際樣品測試。

3.5?不同茶葉提取液中GABA的含量測定

使用DART-MS和HPLC分別測定了10種不同茶葉提取液中的GABA含量。結(jié)果見圖5和表2。由圖5可見，傳統(tǒng)HPLC法測得的結(jié)果和DART-MS法測得的結(jié)果相近，具體結(jié)果見表2。不同茶葉中的GABA含量存在明顯差異，其中，九香翠芽的GABA含量最高，為227.2 μg/g; 其次是信陽毛尖，GABA含量為161.2 μg/g; GABA含量最低的是日照綠茶，為75.6 μg/g。不同茶葉品種中GABA含量的差異可能是由于茶葉的品種、所處的地理位置、氣候、濕度以及不同的加工處理方法等因素造成的。

4?結(jié) 論

利用DART-MS法測定了10種不同茶葉中的GABA含量。10種不同茶葉中GABA含量各不相同，由高到低依次為： 九香翠芽，信陽毛尖，茉莉花茶，桑葉茶，祁門紅茶，龍井綠茶，金駿眉，五洲山綠茶，信陽毛峰和日照綠茶。 其中，九香翠芽的GABA含量高達227.2 μg/g，而日照綠茶的GABA含量為75.6 μg/g。 采用DART-MS法所測得的GABA含量的精密度較好，測得的結(jié)果和傳統(tǒng)HPLC法測得的結(jié)果一致，表明本方法的準確性較好。與傳統(tǒng)的HPLC法相比，本方法前處理過程簡單，無需衍生化，分析時間短，靈敏度高，具有良好的實用性。本研究為茶葉中GABA的定性與定量測定提供了一種快速高效的方法，同時也為測定茶葉中其它種類氨基酸的分析檢測提供了參考。

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