劉文晗 謝曉冬 殷 敏 陳 楠

1（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所中國(guó)科學(xué)院微觀界面物理與探測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海201800）

2（中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京100049）

3（上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 上海200234）

貴金屬（如金、銀、鉑等）納米材料具有獨(dú)特的物 理、化學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，因而被廣泛應(yīng)用于化學(xué)傳感、生物檢測(cè)和醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域［1-7］。貴金屬納米材料之所以能在腫瘤成像和靶向放射治療中發(fā)揮作用［5，8-9］，是因?yàn)閷?shí)體腫瘤組織普遍具有提高滲透滯留（Enhanced Permeability and Retention，EPR）效應(yīng)，納米顆粒容易在腫瘤部位發(fā)生富集［10］。由于貴金屬納米粒子具有較高的原子序數(shù)和X 射線吸收系數(shù)，所以可作為腫瘤體內(nèi)成像的造影劑以及放射治療的增敏材料［11-12］。納米貴金屬能夠有效地吸收X射線并與輻射相互作用，發(fā)射二次電子，這些二次電子既可以直接造成DNA的損傷［13-15］，又可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性，從而實(shí)現(xiàn)以較低的劑量射線獲得良好的放療效果［16-17］。

貴金屬納米材料還具有局域表面等離子體共振（Localized Surface Plasmon Resonance，LSPR）效應(yīng)。研究人員基于其LSPR 效應(yīng)開發(fā)了一系列傳感器，這些傳感器具有實(shí)時(shí)和高靈敏等特點(diǎn)，且無需標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)和生物檢測(cè)。雖然電化學(xué)傳感和基于框架核酸的新型檢測(cè)手段等在多種疾病的診斷中發(fā)揮了重要作用，但是成像學(xué)的方法，在對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和診斷時(shí)具有高靈敏性和實(shí)時(shí)性等優(yōu)勢(shì)［18-20］?；诩{米貴金屬的LSPR 效應(yīng)所制備的等離子體納米探針（Plasmonic Nanoprobes，PNPs）具有明顯區(qū)別于生物組織的散射光顏色和光譜信號(hào)，可以利用暗場(chǎng)顯微鏡（Dark Field Microscope，DFM）進(jìn)行觀測(cè)［21-23］。與熒光探針相比，PNPs具有更高的靈敏性和特異性，且不容易發(fā)生光漂白，暗場(chǎng)成像過程也避免了激光直接照射細(xì)胞所產(chǎn)生的毒性，特別適合用來對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)。對(duì)于PNPs 在細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)行為的研究，則為更好地理解細(xì)胞生命活動(dòng)的過程提供了可能［24-25］。此外，等離子體納米探針的LSPR效應(yīng)對(duì)于其周圍的介電常數(shù)非常敏感，能夠?qū)崟r(shí)反映觀測(cè)過程中環(huán)境的變化，因而具有更快的響應(yīng)速度和更高的檢測(cè)靈敏度［26］。除了單個(gè)PNP 的形貌對(duì)于其LSPR 效應(yīng)的影響，兩個(gè)或多個(gè)納米探針相互靠近，會(huì)顯著改變其局部電荷分布，最終導(dǎo)致散射光譜的紅移，這種效應(yīng)被稱作等離子體耦合（Plasmon Coupling）?；谠撔?yīng)所設(shè)計(jì)的納米等離子尺等探針體系，使得實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物分子動(dòng)態(tài)過程中的距離變化成為可能［27-28］。

本文綜述了國(guó)內(nèi)外基于暗場(chǎng)成像的PNPs 的最新進(jìn)展，重點(diǎn)介紹其在細(xì)胞成像方面的應(yīng)用；總結(jié)了利用PNPs觀測(cè)細(xì)胞膜表面受體、原位檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的生物分子和實(shí)時(shí)追蹤胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑等方面的應(yīng)用，并展望了這一領(lǐng)域的發(fā)展前景。

1 等離子體納米探針與暗場(chǎng)顯微成像技術(shù)

1.1 等離子體納米探針

具有LSPR 效應(yīng)的納米顆粒被用作等離子體納米探針，對(duì)生物分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記、檢測(cè)和實(shí)時(shí)成像。就化學(xué)組成而言，PNPs 包括納米金（Gold Nanoparticles， AuNPs） 、 納 米 銀 （Silver Nanoparticles，AgNPs） 、 納 米 鉑 （Platinum Nanoparticles，PtNPs）和包含這些貴金屬成分的復(fù)合納米顆粒等。PNPs 的化學(xué)組分和尺寸決定其光學(xué)性質(zhì)。例如，粒徑為40 nm 單顆粒球形AuNPs 探針在暗場(chǎng)下呈現(xiàn)綠色光斑，而相同大小的AgNPs則具有藍(lán)色散射光信號(hào)。對(duì)于球形PNPs，其散射吸收可以用Mie理論［29］解釋，隨著粒徑增大，球形PNP的散射光強(qiáng)度增強(qiáng)。此外，納米顆粒的形貌也會(huì)對(duì)其LSPR 光學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響。隨著納米顆粒的合成技術(shù)日趨成熟，多種具有復(fù)雜形貌結(jié)構(gòu)的PNPs 被合成，如：球形、棒狀、二維多邊形、三維多邊體、分枝狀、復(fù)雜型和空心結(jié)構(gòu)等［30］。其中，由于其化學(xué)惰性和優(yōu)異的生物兼容性，各種形貌的納米金探針被制備和應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記及成像分析。在最近的一項(xiàng)研究 中 ，Chakkarapani 等［31］根 據(jù) 納 米 金 棒（Gold Nanorods，AuNRs）各向異性的光學(xué)特性，利用集成光片成像的超分辨顯微鏡實(shí)時(shí)觀察了單個(gè)PNP 在聚集體中的三維取向，獲得了低至64 nm 的軸向分辨率和28 nm 的空間分辨率（圖1（a））。Zhang 等［32］利用DNA 介導(dǎo)的定向自組裝技術(shù)制備了等離子體性質(zhì)可調(diào)的海參狀金納米晶（Gold Nanocrystals，AuNCs）。時(shí)域有限差分（Finite-difference Timedomain，F(xiàn)DTD）方法的計(jì)算結(jié)果表明：等離子體共振峰的變化與合成的AuNCs的尺寸、形貌的精確變化是一致的；該AuNCs 具有良好生物相容性，可以用于光熱治療和成像分析（圖1（b））。如圖1（c）所示，Shen 等［33］借助Poly-A30寡核苷酸鏈對(duì)納米金的表面生長(zhǎng)過程進(jìn)行控制，得到了一系列粒徑約50 nm的帶“刺突”的納米金星結(jié)構(gòu)，隨刺突的長(zhǎng)度和粗細(xì)比（δ）增大，其對(duì)應(yīng)的LSPR 散射光信號(hào)顏色從暗綠色逐步變化至橙紅色，相應(yīng)的散射光譜也從560 nm紅移至660 nm左右。該方法得到了超多元化的PNPs，其對(duì)應(yīng)的特征光譜種類超過了傳統(tǒng)熒光探針的多色極限。研究者們借助該探針，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的標(biāo)記和實(shí)時(shí)定量成像。此外，這類帶有突刺結(jié)構(gòu)的PNPs，由于尖端的電荷分布更為密集，其LSPR 性質(zhì)對(duì)于周圍環(huán)境的敏感性也比球形對(duì)稱結(jié)構(gòu)的納米探針要高。因此，利用各種手段，如DNA納米技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)PNPs形貌的設(shè)計(jì)和調(diào)控，從而制備超多色和超靈敏的生物探針成為了新的發(fā)展趨勢(shì)。

圖1 多種形貌的納米等離子探針(a)納米金棒的光片三維成像[31]，(b)海參狀納米金探針[32]，(c)形貌可控的多色納米金星探針[33]Fig.1 Plasmonic probes with varied shapes(a)3D light sheet imaging with nanorods[31],(b)The trepang-like Au nanocrystals[32],(c)The tunable multiplex gold nano-star probes[33]

1.2 暗場(chǎng)顯微成像技術(shù)

暗場(chǎng)顯微成像技術(shù)是檢測(cè)單個(gè)納米顆粒散射光信號(hào)的有效手段。暗場(chǎng)顯微鏡可以觀測(cè)到粒徑在20～200 nm的PNPs 的信號(hào)，并可檢測(cè)到探針粒子間僅數(shù)納米的距離改變，突破了普通光學(xué)顯微鏡約200 nm 的空間分辨率限制［34］。暗場(chǎng)顯微鏡成像和采集光譜的原理如圖2（a）所示，鹵素?zé)艋虬准す獍l(fā)出的入射光通過裝配有暗場(chǎng)環(huán)的暗場(chǎng)聚光鏡之后，形成環(huán)形光，斜照射在樣品上，在樣品下方使用一個(gè)數(shù)值孔徑小于聚光鏡的物鏡，收集樣品的散射光，并將光學(xué)信號(hào)通過顯微鏡鏡片系統(tǒng)傳遞至暗場(chǎng)成像感光電荷耦合元件（Charge-coupled Device，CCD），然后透過狹縫到達(dá)光譜儀中，從而分別獲得樣品的暗場(chǎng)圖像和散射光譜。這類暗場(chǎng)光譜儀通過狹縫采集單顆粒PNP 的高精度光譜，適合于構(gòu)建生化體系中的超靈敏探針［35］。如果需要同時(shí)采集視野內(nèi)多個(gè)探針的光譜，就需要利用高光譜暗場(chǎng)顯微成像系統(tǒng)，基于狹縫型的高光譜速度較慢，如El-Khoury 等［36］對(duì)44 μm×59 μm面積內(nèi)的數(shù)百個(gè)納米銀顆粒采集高光譜，需要大約30 s。之后Kirchner 等［37］研發(fā)了一種“快照型”設(shè)備，可以同時(shí)采集圖像和視野內(nèi)所有粒子的光譜，整個(gè)視野的光譜掃描時(shí)間縮短至1 ms，且光譜的分辨率仍能保持0.21 nm，如圖2（b）所示，樣品的信號(hào)通過分光鏡后，同時(shí)進(jìn)入成像系統(tǒng)和光譜掃描系統(tǒng)。光譜采集不是通過狹縫，而是直接使用透射光柵片，使光線發(fā)生平行衍射，在CCD 上形成光譜條紋。這一系統(tǒng)要求樣品中探針的分布比較稀疏，否則掃描得到的單顆粒光譜信號(hào)的拉伸條紋會(huì)互相重疊。

圖2 暗場(chǎng)光譜采集裝置(a)彩色CCD、光譜CCD和狹縫光譜儀耦合的暗場(chǎng)顯微鏡示意圖[35]，(b)快照型暗場(chǎng)高光譜光路示意圖[37]Fig.2 Setups of dark-field spectroscopies(a)Dark-field microscope coupled with color CCD,spectro-CCD and a slit-spectrometer[35],(b)Snapshot hyperspectral imaging setup[37]

2 等離子體納米探針與細(xì)胞成像研究

2.1 用于研究細(xì)胞膜表面受體的PNPs

細(xì)胞膜表面存在多種多樣的受體蛋白，它們能識(shí)別、結(jié)合特異的配體分子，從而激活和啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)途徑，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的生理過程發(fā)生相應(yīng)的變化［38-39］。研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，受體在細(xì)胞膜表面的運(yùn)動(dòng)和聚集常常是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵步驟。因此，針對(duì)細(xì)胞膜表面受體的分布和聚集進(jìn)行研究，有助于理解其生理功能［40-42］。將PNPs 與識(shí)別膜受體的特異性抗體進(jìn)行偶聯(lián)，使之能夠結(jié)合和標(biāo)記活細(xì)胞表面受體，便于在暗場(chǎng)顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。這種基于等離子體納米探針的暗場(chǎng)成像方式，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成侵入性損傷，且探針不易發(fā)生光漂白，適合進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)。更重要的是，當(dāng)膜受體發(fā)生聚集時(shí)，探針粒子間距離的改變會(huì)造成其散射光譜和暗場(chǎng)圖像顏色的改變（圖3（a））。例如，Wang等［43］利用抗體標(biāo)記的納米金探針，對(duì)于跨膜蛋白ErbB1 和ErbB2在不同種類癌細(xì)胞表面的分布進(jìn)行了成像分析（圖3（a））。隨著受體密度增大，納米金探針間的距離縮短，當(dāng)顆粒間的距離小于顆粒表面等離子體耦合發(fā)生的距離（＜5 nm）時(shí)，散射光波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生明顯的紅移，并伴隨散射光強(qiáng)的增加。此外，Wang等［44］先根據(jù)不同聚集程度的納米銀探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的暗場(chǎng)散射光譜，將團(tuán)聚的納米銀分為4類，然后用修飾有表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）抗體的30 nm 納米銀探針與A431細(xì)胞進(jìn)行孵育后，根據(jù)探針的分布和對(duì)應(yīng)的暗場(chǎng)散射光譜，定量描述了細(xì)胞膜表面EGFR的表達(dá)、密度和空間分布（圖3（b））。另外，該研究組還利用修飾有EGFR 抗體的粒徑為40 nm 的納米金觀察到了EGFR 在細(xì)胞偽足結(jié)構(gòu)上的富集分布，并用掃描電鏡（Scanning Electronic Microscopy，SEM）成像結(jié)果印證了這一發(fā)現(xiàn)［44］。在近期的一項(xiàng)研究工作中，Guo等［45］利用抗體修飾的納米金探針對(duì)于細(xì)胞膜表面的人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）進(jìn)行了原位暗場(chǎng)成像（圖3（c）），他們?cè)O(shè)計(jì)了一對(duì)非對(duì)稱的納米金探針，1號(hào)探針（Au1）修飾有HER2抗體和炔基，2號(hào)探針（Au2）修飾有疊氮基和能夠起始滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增（Rolling Circle Amplification，RCA）的DNA 鏈。在銅離子存在下，銅催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)引發(fā)納米金探針的聚集和光譜的紅移，而RCA反應(yīng)則進(jìn)一步增強(qiáng)了紅移效應(yīng)。這一策略將RCA 引入暗場(chǎng)顯微成像分析，為利用暗場(chǎng)顯微鏡在活細(xì)胞水平觀測(cè)多種生物分子提供了可能。

2.2 用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物分子進(jìn)行原位觀測(cè)的PNPs

納米金、納米銀等探針可以被大多數(shù)類型的細(xì)胞所攝取，通過對(duì)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞的PNPs進(jìn)行成像和示蹤，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于生物分子的檢測(cè)和分析。

PNPs可以與細(xì)胞內(nèi)的小分子發(fā)生相互作用，在此過程中探針的光散射信號(hào)發(fā)生改變，反映出目標(biāo)分子空間分布和局部濃度的變化。例如，Xiong等［46］發(fā)展了一種以核殼結(jié)構(gòu)的Au@Ag復(fù)合納米棒為探針，通過單粒子暗場(chǎng)散射光譜，對(duì)活細(xì)胞中內(nèi)源性的硫化氫進(jìn)行原位檢測(cè)的成像技術(shù)。由于硫化物對(duì)于銀的刻蝕作用，在探針表面形成Ag2S，誘導(dǎo)光譜發(fā)生紅移，因此通過檢測(cè)光譜變化的動(dòng)力學(xué)，能間接測(cè)定局部硫化物濃度及其波動(dòng)（圖4（a））。

PNPs也可用于蛋白酶活力的測(cè)定。Tajon等［28］構(gòu)建了一種納米等離子體“尺子”，包含兩個(gè)多層核殼結(jié)構(gòu)的Zn0.4Fe2.6O4@SiO2@Au納米顆粒，兩個(gè)顆粒以一段可以被蛋白酶caspase-3 特異性識(shí)別和切割的肽鏈連接。Caspase-3 是細(xì)胞激活凋亡過程的標(biāo)志性蛋白酶，細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，caspase-3 活性上升，將兩個(gè)納米顆粒中間的連接序列切斷，由于等離子體耦合作用的消失，散射光的強(qiáng)度發(fā)生明顯下降（圖4（b））。通過暗場(chǎng)顯微鏡對(duì)納米等離子體“尺子”的光強(qiáng)進(jìn)行成像和定量分析，研究者們?cè)谒幬锾幚淼穆园籽〖?xì)胞K562 細(xì)胞中檢測(cè)到了2～4 倍的caspase-3活性上調(diào)。該探針為實(shí)現(xiàn)可視化的高通量藥物篩選提供了全新的可能。

最近，Wang等［47］利用等離子體納米探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)于單個(gè)細(xì)胞內(nèi)表觀遺傳信息的定位和定量表征。如圖4（c）所示，納米金和納米銀顆粒分別被修飾了針對(duì)不同胞嘧啶修飾形式的抗體，由于探針間距離靠近會(huì)引起光譜紅移，利用高光譜暗場(chǎng)顯微成像實(shí)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)胞嘧啶羧基修飾（5-carboxylcytosine，5caC）的定量和空間定位，還得到了局部的修飾基團(tuán)密度。研究者們通過比較不同細(xì)胞周期的成像結(jié)果，證明5caC這種表觀遺傳修飾在細(xì)胞周期中仍能保持穩(wěn)定。

圖3 暗場(chǎng)成像檢測(cè)細(xì)胞表面受體分布(a)納米金免疫標(biāo)記ErbB跨膜蛋白[43]，(b)納米銀標(biāo)記EGFR受體蛋白分布密度[44]，(c)納米金RCA反應(yīng)原位標(biāo)記HER2蛋白分布[45]Fig.3 Cell membrane receptors distribution detection by dark-field microscopy(a)ErbB transmembrane protein immunolabeled by AuNP[43],(b)EGFR receptor density mapped by AgNP probes[44],(c)In situ labeling of HER2 proteins by RCA reaction with AuNP probes[45]

等離子體納米探針在核酸成像分析方面也得到了廣泛應(yīng)用。Lee 等［48］在粒徑為40 nm 的納米金表面分別修飾了兩條DNA單鏈，它們能夠與乳腺癌易發(fā)基因（Breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）的兩段外顯子（exon8和exon12）對(duì)應(yīng)的mRNA序列互補(bǔ)結(jié)合。如圖5 所示，對(duì)于正常細(xì)胞內(nèi)的BRCA1剪切形式，exon8和exon12相隔較遠(yuǎn)，結(jié)合的納米金探針不容易發(fā)生耦合；而對(duì)于一些突變致癌類型的mRNA，由于exon9、exon10、exon11在mRNA剪接的過程中丟失，exon8和exon12序列相鄰，結(jié)合的納米金探針距離靠近，引起LSPR 光譜發(fā)生紅移。這一方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)于不同形式mRNA 剪接中間體的可視化，高靈敏的分辨。在最近的一項(xiàng)研究工作中，Li等［49］使用一對(duì)修飾有兩段非對(duì)稱DNA序列的、粒徑為20 nm 的納米金探針，這兩個(gè)探針能夠識(shí)別和結(jié)合同一mRNA分子的相鄰序列。單個(gè)20 nm的納米金的LSPR 散射光強(qiáng)度不足以被暗場(chǎng)顯微鏡捕捉，從而降低了游離探針的背景信號(hào)。當(dāng)目標(biāo)mRNA分子存在時(shí)，兩個(gè)納米金探針結(jié)合形成的納米金二聚體發(fā)生等離子體耦合，散射光強(qiáng)度大大提高。研究者們成功地利用該探針在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到了單個(gè)mRNA分子。

2.3 用于觀察細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程的PNPs

等離子體納米探針具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性，特別適合活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像，被應(yīng)用于納米顆粒的攝取和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程的研究。Qian 等［50］依托活細(xì)胞暗場(chǎng)成像系統(tǒng)，對(duì)攝取了納米金探針（30 nm）的細(xì)胞進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)數(shù)十個(gè)小時(shí)的連續(xù)觀察，捕捉到了修飾有核定位信號(hào)肽（Nuclear Localization Signal，NLS）的納米金進(jìn)入細(xì)胞核的動(dòng)態(tài)過程，并觀測(cè)了完整的細(xì)胞分裂周期過程中PNPs 的分布變化。納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞后，普遍會(huì)發(fā)生團(tuán)聚，聚集狀態(tài)會(huì)對(duì)其生物學(xué)功能（如載藥、光熱治療等）產(chǎn)生影響［51-52］。傳統(tǒng)的熒光探針很難對(duì)納米顆粒的聚集狀態(tài)進(jìn)行精確的分析。PNPs發(fā)生團(tuán)聚時(shí)，聚集體內(nèi)的粒子數(shù)與其散射光譜的波長(zhǎng)存在相關(guān)性，這一特性被用來區(qū)分探針在細(xì)胞內(nèi)的團(tuán)聚程度。為了更準(zhǔn)確地對(duì)暗場(chǎng)圖像進(jìn)行識(shí)別，研究人員將暗場(chǎng)圖像從常用的紅綠藍(lán)（RGB）三色模型轉(zhuǎn)換為包含有色度（Hue，H）、飽和度（Saturation，S）、亮度（Brightness，B）的HSB 顏色模型，后者能夠更加準(zhǔn)確地表現(xiàn)光譜特征［53］。借助于HSB 模型，Wang 等［54］對(duì)于納米金聚集引起的顏色變化進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)暗場(chǎng)圖像中信號(hào)的亮度和色度的比值與聚集體中包含的顆粒數(shù)目具有良好的相關(guān)性（圖6（a））?；谶@一發(fā)現(xiàn)，該研究組進(jìn)一步利用截面暗場(chǎng)顯微鏡對(duì)于細(xì)胞內(nèi)納米金探針的聚集狀態(tài)進(jìn)行了成像和分析［25］。結(jié)果表明：細(xì)胞內(nèi)的納米金探針可以根據(jù)其團(tuán)聚程度分為4 類（N=1～3、N=4～6、N=7～12、N≥12）。為了實(shí)時(shí)地追蹤納米金在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和聚集的過程，Liu等［55］發(fā)展了暗場(chǎng)和熒光聯(lián)用的顯微成像系統(tǒng)，通過納米金表面修飾帶有熒光的DNA 鏈，構(gòu)建了同時(shí)具有LSPR 散射光信號(hào)和熒光信號(hào)的雙標(biāo)納米金探針（fPlas-gold），通過表達(dá)融合熒光蛋白的方式，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的微管結(jié)構(gòu)和內(nèi)涵體、溶酶體等細(xì)胞器進(jìn)行了熒光標(biāo)記，結(jié)合熒光和暗場(chǎng)兩個(gè)通道的成像信息，研究者們實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地觀測(cè)了納米金顆粒被細(xì)胞攝取、在胞內(nèi)沿著微管轉(zhuǎn)運(yùn)并不斷聚集的過程（圖6（b）），并首次揭示了聚集體大小對(duì)其運(yùn)動(dòng)速率的影響。

圖4 暗場(chǎng)成像檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)分子(a)Au@Ag復(fù)合納米棒實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)胞內(nèi)硫化氫[46]，(b)納米等離子尺子監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡過程[28]，(c)抗體修飾AuNP和AgNP等離子納米探針檢測(cè)染色質(zhì)胞嘧啶羧基修飾[47]Fig.4 Intracellular molecule real-time monitoring by dark-field microscopy(a)Intracellular sulphide sensing with Au@Ag core-shell nanorod[46],(b)Apoptosis detected by plasmon ruler[28],(c)Chromatin 5caC modification probed by immunolabeled AuNPs and AgNPs[47]

細(xì)胞在暗場(chǎng)成像時(shí)容易產(chǎn)生較為嚴(yán)重的散射光背景，通過使用甘油、蔗糖等介質(zhì)提高樣品的折射率等手段能夠減弱細(xì)胞背景［56］，但這種方法并不適用于活細(xì)胞樣品的觀察。為了實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)PNPs 信號(hào)的高通量自動(dòng)化分析，使用偏置模糊聚類算法（Biasmodified Fuzzy C-means algorithm，BM-FCM）［57］在減少?gòu)浬⑿缘纳⑸浔尘案蓴_方面取得了較好的效果［58］。然而，該方法并不能有效地過濾一些由細(xì)胞內(nèi)的囊泡或者脂肪滴所形成的點(diǎn)狀散射光斑。目前，對(duì)于暗場(chǎng)圖片中細(xì)胞內(nèi)的等離子體探針信號(hào)，仍然需要對(duì)暗場(chǎng)粒子光斑的形狀和顏色進(jìn)行人工判斷，或通過采集光譜的方法來進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。

3 總結(jié)與展望

研究納米材料與細(xì)胞的相互作用，對(duì)于促進(jìn)多種納米載體、納米探針和診療制劑的臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。作為一種與熒光成像互補(bǔ)的技術(shù)，暗場(chǎng)顯微成像在活細(xì)胞的可視化研究方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。近期，研究者們?cè)诘入x子體納米探針的優(yōu)化和暗場(chǎng)成像系統(tǒng)的改進(jìn)方面取得許多進(jìn)展，促進(jìn)了活細(xì)胞暗場(chǎng)成像的應(yīng)用。本文介紹了等離子體納米探針的最新進(jìn)展，分三個(gè)方面總結(jié)了等離子體納米探針在細(xì)胞成像中的應(yīng)用。目前，在熒光成像領(lǐng)域，已有許多成熟而高效的軟件系統(tǒng)可以進(jìn)行圖像的自動(dòng)化處理和數(shù)據(jù)分析，而暗場(chǎng)的圖像和數(shù)據(jù)分析手段較為滯后，常常依賴于有經(jīng)驗(yàn)的研究者進(jìn)行手動(dòng)分析，亟需開發(fā)相應(yīng)的自動(dòng)化數(shù)據(jù)分析工具。相信隨著等離子體納米探針的進(jìn)一步優(yōu)化，暗場(chǎng)顯微成像技術(shù)會(huì)對(duì)細(xì)胞研究產(chǎn)生更為深遠(yuǎn)的影響。

圖5 納米金探針耦合檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中的mRNA剪接[48]Fig.5 Detection of mRNA splicing based on plasmon coupling of AuNPs[48]

圖6 納米金聚集與胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)(a)納米金聚集體暗場(chǎng)和對(duì)應(yīng)的SEM圖像[49]，(b)fPlas-gold探針被細(xì)胞攝取和在胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)與聚集[55]Fig.6 AuNP aggregation and intracellular trafficking(a)The correlative dark-field images and SEM images of aggregates with increasing number of AuNPs[49],(b)The internalization and trafficking of fPlas-gold[55]