林曉紅,陳 柳,高亞娟,燕 鳳,李 佳,楊 紅

(中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710032;*通訊作者,E-mail:yanghongfck@163.com)

宮頸癌是發(fā)病率非常高的婦科惡性腫瘤之一,嚴重威脅著女性的生命健康,我國近10年來發(fā)病率呈上升趨勢并且呈年輕化趨勢[1-3],如何有效地防控宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展顯得尤為重要。大量研究已經(jīng)證實宮頸癌發(fā)病的主要原因是人乳頭瘤病毒(HPV)的長期持續(xù)感染[4,5]。HPV為小DNA病毒,呈球形,無包膜,20面立體對稱結構。基因組是雙鏈環(huán)狀、以共價閉合的超螺旋、開放的環(huán)狀DNA結構。侵染人的上皮黏膜細胞,通常引起生殖器疣、子宮頸和肛門癌。HPV的基因組包含3個基因區(qū):不編碼蛋白的長調控區(qū)(LCR),早期基因區(qū)(E1,E2,E4,E5,E6,E7)和晚期基因區(qū)(L1,L2)。早期基因的產(chǎn)物用于病毒的復制擴增,晚期基因的產(chǎn)物用于包裝病毒。其中,E6、E7為宮頸癌的致癌基因。宮頸癌作為目前唯一明確病因的婦科腫瘤,可以通過有效的篩查做到早發(fā)現(xiàn)早治療,從而有效防控宮頸癌前病變的發(fā)生與發(fā)展。目前宮頸癌篩查主要以細胞學和HPV基因檢測聯(lián)合篩查為主,對于疑似宮頸病變的患者轉陰道鏡活檢。臨床上對于子宮頸上皮內瘤變的管理是按照規(guī)范操作,平衡利與弊,避免診斷與治療的不足與過度。因為CIN1多為HPV一過性感染所致,自然消退率很高,因此對于低級別鱗狀上皮內瘤變(LSIL,即CIN1)的患者,原則上是無需治療,隨診觀察。而對高級別鱗狀上皮內瘤變(HSIL,即CIN2和CIN3)和原位癌患者,則應及時予以治療,阻斷發(fā)展為子宮頸浸潤癌的可能性,從而減少子宮頸浸潤癌的發(fā)生。本研究通過比較分析HPV E6/E7 mRNA檢測和HPV DNA分型檢測在臨床宮頸病變患者中的檢測結果,探討兩種HPV基因檢測方法在宮頸癌篩查中的應用效果及對宮頸病變的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2016年3月至2018年3月在本院婦科門診就診的患者(包括健康體檢者和有臨床癥狀表現(xiàn)為宮頸炎癥、陰道不規(guī)則出血等的患者,排除既往患有宮頸癌前病變、近期有激素使用史的患者),均行HPV E6/E7 mRNA檢測和HPV DNA分型檢測的患者的臨床資料,其中發(fā)現(xiàn)疑似宮頸病變轉陰道鏡活檢的患者916例,年齡為20-76歲,平均年齡(42.7±11.9)歲。以活檢結果為金標準,對HPV E6/E7 mRNA檢測和HPV DNA分型檢測結果進行比較分析。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 避開月經(jīng)期,取樣前3 d內無陰道上藥和沖洗,24 h內無性生活,采用專用的采樣刷,于宮頸鱗狀上皮和柱狀上皮交界處,沿順時針方向旋轉5-7圈后置于專用的標本保存液中。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測 使用Quanti VirusTMHPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒(試劑盒和檢測儀器來源于河南科蒂亞生物技術有限公司)可檢測WHO公布的14種高危亞型HPV E6/E7 mRNA(HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68),不分型。采用支鏈DNA信號放大技術,標本經(jīng)過裂解、雜交捕獲、信號放大、酶促化學發(fā)光,通過冷光儀檢測,超過發(fā)光閾值為陽性。

1.2.3 HPV DNA分型檢測 使用HPV27全分型檢測試劑盒(源于上海透景生命科技股份有限公司)可檢測13種高危亞型HPV(HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66)和4種可能高危亞型HPV(HPV 68,26,53,82)及10種低危亞型(HPV 6,11,40,42,43,44,55,61,81,83)。采用流式熒光技術,標本經(jīng)過核酸提取,PCR擴增、雜交,通過Luminex-200儀檢測信號,結果大于150的型別為陽性。

1.2.4 陰道鏡檢查及宮頸活檢 宮頸充分暴露后,使用4%醋酸溶液涂抹整個宮頸,全面觀察后用碘液涂抹,充分觀察對白色病變、點狀血管、碘不著色等可疑病變部位行多點取樣及宮頸搔刮術。采集的活檢組織使用甲醛固定處理,送至病理科進行活檢:標本經(jīng)脫水、組織包埋、切片、染色、封片后,由2位專業(yè)的病理診斷醫(yī)生進行閱片診斷,診斷結果描述采用世界衛(wèi)生組織三級分類法,分為宮頸炎癥、輕度宮頸上皮內瘤變(CIN1)、中度宮頸上皮內瘤變(CIN2)、重度宮頸上皮內瘤變(CIN3)和宮頸癌。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,采用靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比及ROC曲線下面積指標評價兩種檢測方法診斷價值,不同宮頸病變分組中HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)采用中位數(shù)(四分位數(shù))表示,組間比較采用非參數(shù)檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 916例行陰道鏡活檢患者檢測結果概況

916例患者的活檢結果:宮頸炎239例,CIN1 342例,CIN2 91例,CIN3 183例,宮頸癌61例。CIN1-3患者共616例,年齡分布:20-29歲79例(12.8%),30-39歲230例(37.4%),40-49歲211例(34.3%),50-59歲71例(11.5%),60-69歲23例(3.7%),年齡≥70歲2例(0.3%)。61例宮頸癌患者年齡分布為:20-29歲2例(3.3%),30-39歲13例(21.3%),40-49歲23例(37.7%),50-59歲14例(23.0%),60-69歲9例(14.7%)。在高級別宮頸病變(CIN2以上)及宮頸癌的335例患者中,單一高危亞型感染率高的型別有HPV16、58、33、31、56、18、52,占比75.6%;雙重感染的患者共39例,占比11.6%。在61例宮頸癌患者中感染HPV16高危亞型的33例,占比54.0%,感染HPV18亞型的6例,占比9.8%。

2.2 HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA分型檢測結果分析

在炎癥組中,HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性率低于HPV DNA分型檢測,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在CIN1和CIN2組中,兩種檢測方法的陽性率差異無統(tǒng)計學意義。CIN3組和宮頸癌組的HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性率高于HPV DNA分型檢測,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表1)。

表1 916例活檢患者HPVE6/E7mRNA和HPV DNA分型檢測結果分析 例(%)

2.3 HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA分型檢測對宮頸病變篩查的臨床價值比較

為了進一步明確HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA分型檢測在宮頸病變篩查中的臨床價值,本研究在活檢結果的基礎上比較了兩種HPV基因檢測方法的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比和陰性似然比(見表2)。結果表明,HPV E6/E7 mRNA檢測的特異性、陽性預測值、陰性預測值,陽性似然比均高于HPV DNA分型檢測,陰性似然比則低于HPV DNA分型檢測。上述差異均有統(tǒng)計學意義。

表2 HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA分型檢測對宮頸病變診斷的臨床價值比較

2.4 不同級別宮頸病變分組中HPV E6/E7 mRNA檢測結果分析

本研究根據(jù)不同宮頸病變級別分組,統(tǒng)計了不同分組中陽性患者HPV E6/E7 mRNA的拷貝數(shù)。結果表明HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)隨著宮頸病變級別的加重而增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表3)。

表3 不同宮頸病變級別的HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)

3 討論

HPV感染大多都是一過性感染,80%以上的婦女一生中都會感染HPV,但是大部分感染都可以在8-24個月內通過自身免疫系統(tǒng)清除,只有約9%-21%會發(fā)展為持續(xù)感染[6]。在感染早期,病毒基因在細胞內處于游離狀態(tài),一過性感染大多處于這個階段。當HPV持續(xù)感染后,病毒基因整合到宿主細胞基因組中,HPV致癌基因E6、E7被激活,利用宿主細胞大量轉錄mRNA并翻譯為E6、E7致癌蛋白。E6蛋白能夠通過與E3泛素化連接酶E6AP結合形成復合體,進一步泛素化修飾p53,使得p53最終被蛋白酶降解而失去功能。由此導致細胞周期紊亂癌變,而隨著細胞的不斷增殖,病毒也得以大量擴增。還有研究表明E6蛋白可以激活細胞端粒酶。由于端粒酶本身具有抑制細胞程序性死亡的作用,因此激活端粒酶可以延長宿主細胞生存時間。E6蛋白不僅自身具有致癌作用,還可與其他致癌蛋白合作,高效地誘導細胞癌變。與E6生物學功能相關最密切的就是E7。有文獻報道,E7可以使抑癌因子pRB失活,導致細胞癌變。此外,作為抗病毒機制,細胞間會通過干擾素進行通訊,而E6、E7蛋白不僅可以下調多種干擾素應答基因還可以直接降低兩種干擾素的表達量,使得病毒逃逸人體免疫[7],另外,E6、E7蛋白可以激活上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT),增強惡性細胞的侵襲力[8-10]。因此,近年來,大量國內外研究認為E6/E7 mRNA的持續(xù)大量表達是宮頸癌變的必要條件。有研究表明在宮頸癌篩查中HPV E6/E7 mRNA較HPV DNA有相近的靈敏度和更高的特異度[11]。

HPV DNA檢測是以HPV的L1基因為靶標,無法排除一過性感染,易引起過度診療,增加患者生理上的痛苦和心理上的負擔。而HPVE6/E7 mRNA檢測是以HPV的致癌基因E6、E7轉錄的mRNA為靶標,可以反映致癌基因的活躍程度,理論上能更好反映癌變轉化風險,同時可以有效減少HPV一過性感染的檢出,減少不必要的陰道鏡轉診。有研究報道活檢結果為CIN1患者有47%-62%可以轉為正常,22%-37%維持原狀,15%-16%會進一步進展;CIN2患者有43%-54%可以轉為正常,16%-35%維持原狀,30%會進一步進展;CIN3患者只有20%-30%可以轉為正常,70%-80%會進一步進展。因此如何準確地篩查分流出宮頸病變高風險的患者,及時治療阻斷宮頸癌發(fā)生發(fā)展顯得尤為重要。

本研究結果顯示,在活檢結果為宮頸炎癥的患者中HPV E6/E7 mRNA的陽性率遠低于HPV DNA檢測的陽性率,差異有統(tǒng)計學意義。這與Baron等[12]的結果一致。這可能是由于大多數(shù)HPV感染是一過性感染,病毒基因并未整合到宿主基因中或者整合程度低,HPV E6/E7 mRNA檢測呈陰性,表示樣本宮頸細胞無惡變轉化風險或者處于靜止期,但HPV DNA檢測仍可以檢測到HPV病毒的存在。在CIN3以上的宮頸高級別上皮內病變中,HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性率高于HPV DNA檢測,差異有統(tǒng)計學意義。其中有7例宮頸癌患者的HPV E6/E7 mRNA呈陽性而HPV DNA檢測呈陰性,可能是在病毒基因整合到宿主基因時,發(fā)生了L1丟失,因此HPV DNA檢測呈陰性;另一方面,血性標本也會影響HPV DNA分型檢測的結果。本研究結果還顯示,在高級別上皮內病變(CIN2及以上)患者中HPV E6/E7 mRNA的靈敏度、特異性,陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比以及ROC曲線下面積AUC均比HPV DNA分型檢測高,表明HPV E6/E7 mRNA檢測對宮頸病變診斷的臨床價值更高。

宮頸病變的發(fā)生和發(fā)展與感染HPV的型別、病毒載量和致癌基因的活躍程度密切相關[13]。在14種高危亞型HPV中,HPV16和HPV18與宮頸癌的發(fā)生關系最密切。本研究結果顯示,61例活檢結果為宮頸癌的患者,感染HPV16高危亞型的33例,占比54.0%,感染HPV18亞型的6例,占比9.8%,雙重感染5例,占比8.2%,雙重感染者均感染HPV16或HPV18,由HPV16和HPV18引起的宮頸癌占72%,這與Lees等[14]的研究結果一致。因此對于HPV16和18陽性的患者應引起足夠重視,另外HPV58、33、31、52、56陽性也應引起重視。HPV E6/E7 mRNA檢測結果拷貝數(shù)在不同程度宮頸病變分組之間存在顯著差異,HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)隨著宮頸病變程度增加而升高,這與國內外研究報道一致,HPV E6/E7 mRNA的拷貝數(shù)與宮頸病變的嚴重程度相關[15-17]。HPV E6/E7mRNA拷貝數(shù)反映著HPV致癌基因表達的活躍程度,拷貝數(shù)越高表示樣本宮頸細胞惡變轉化風險越高。對于細胞學篩查結果為ASCUS以及病理結果為CIN1-2的患者,可以根據(jù)E6/E7 mRNA拷貝數(shù)進行分流。HPV E6/E7 mRNA檢測對于篩查出宮頸病變高風險的患者,并及時采取治療,阻斷宮頸癌發(fā)生發(fā)展具有重要的參考意義。

宮頸癌篩查最理想的結果是篩查益處最大化,潛在風險最小化:需要識別可能發(fā)展為浸潤癌的宮頸癌前病變和原位癌并及時給予阻斷治療,還要避免對一過性HPV感染及其導致的良性病變的探查和不必要的治療,甚至過度治療。本研究表明,HPV E6/E7 mRNA檢測與高級別宮頸病變的相關性更強,對宮頸病變的發(fā)生發(fā)展有很好的預測意義,對宮頸病變的診斷價值高于HPV DNA分型檢測,是臨床診療中更高效可靠的篩查方法。