彭 侃,魯 超,胡守業(yè),井文森,王 波

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬紅會醫(yī)院關(guān)節(jié)病醫(yī)院骨壞死與關(guān)節(jié)重建病區(qū),西安 710054;*通訊作者,E-mail:pengkan00@126.com)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種嚴重的關(guān)節(jié)退行性疾病,常導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)疼痛和殘疾,其主要發(fā)病人群為老年人[1]。目前,骨關(guān)節(jié)炎的常用治療措施包括關(guān)節(jié)內(nèi)注射非甾體類抗炎藥(NSAIDs)和細胞外基質(zhì)(ECM)透明質(zhì)酸成分,雖然上述療法可在一定程度上緩解關(guān)節(jié)痛,但其治療效果時效較短(1-4周)[2]。此外,關(guān)節(jié)置換手術(shù)僅適用于對治療無效的重癥骨關(guān)節(jié)炎患者,并且關(guān)節(jié)置換假體的壽命有限[3]。關(guān)節(jié)軟骨損傷是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的主要特征之一,但是骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)能力較低。

大量研究證實間充質(zhì)干細胞(MSC)具有自我更新能力并具有分化成多種譜系的潛力,現(xiàn)已被廣泛用于治療多種慢性疾病[4]。此外,MSC已經(jīng)逐步應(yīng)用于軟骨修復(fù)和骨關(guān)節(jié)炎治療中[5]。然而,現(xiàn)有研究表明MSC的分化能力并不強,只有少數(shù)注射的細胞可黏附于軟骨缺損部位[6,7]。據(jù)報道,與其他來源的MSC相比,人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSC)具有較低免疫原性,不會引起明顯的免疫排斥反應(yīng),所以hUC-MSC是同種異體移植的合適選擇[8]。因此,誘導(dǎo)hUC-MSC產(chǎn)生軟骨分化潛能可能有助于提高骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中的軟骨修復(fù),然而,目前這方面的研究較少。

研究表明,一些microRNA(miRNA)在軟骨形成和骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生中發(fā)揮重要作用,并且miRNA具有調(diào)節(jié)MSC生長分化的功能[9,10]。miR-140-5p是軟骨形成中的關(guān)鍵正調(diào)控因子,其可靶向調(diào)控MMP13、ADAMTS5、SOX9等基因來抑制炎癥和促進軟骨形成,其在預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎方面具有較高的潛力[11-13]。

因此,本研究通過慢病毒將miR-140-5p轉(zhuǎn)染至hUC-MSC,將其在骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型中進行關(guān)節(jié)內(nèi)注射,以探討高表達miR-140-5p的hUC-MSC在治療骨關(guān)節(jié)炎方面的潛在應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 大鼠及主要試劑

60只SPF級8周齡雄性SD大鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心(SYXK(陜)2018-001)提供。DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;成骨和成脂分化培養(yǎng)基購自賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司;FITC標記一抗(CD29、CD34、CD45、CD90、CD105和IgG)購自美國BioLegend公司;miR-140-5p模擬物或抑制劑、過表達miR-140-5p的重組慢病毒載體pLenO-DCE-Puro-miR-140-5p和空慢病毒載體委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;293T細胞購自北京索萊寶科技有限公司;茜素紅染色和油紅O染色試劑盒購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;Polybrene儲液、MTT測定試劑購自美國Sigma公司;Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;PrimeScriptTMRT試劑盒、SYBR Premix Ex Taq購自日本TaKaRa公司;用于Western blot的一抗和二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司;Pierce ECL化學(xué)發(fā)光液購自美國ThermoFisher公司;

1.2 hUC-MSC的分離和培養(yǎng)

無菌收集西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬紅會醫(yī)院正常足月剖宮產(chǎn)健康新生兒臍帶標本并在4 ℃保存。本研究已獲得本院倫理委員會批準，獲得患者監(jiān)護人的知情同意后對標本進行收集。取5 cm左右的臍帶置于含有DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,然后在無菌環(huán)境中取出臍帶,PBS沖洗并剔除血管,剝離出華通膠并剪碎成組織塊,將組織塊接種于含hUC-MSC培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。每3 d更換培養(yǎng)基1次,每天觀察細胞的生長情況;待組織塊周圍長滿細胞時,更換培養(yǎng)基,當融合率達到80%-90%時,用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.3 成骨和成脂分化及染色

根據(jù)說明書分別使用成骨和成脂分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化進行評估。根據(jù)試劑盒說明,通過茜素紅染色考察hUC-MSC的成骨分化能力,通過油紅O染色試考察hUC-MSC的成脂分化能力,然后在Olympus顯微鏡下進行觀察(×100)。

1.4 流式細胞術(shù)鑒定人臍帶間充質(zhì)干細胞

hUC-MSC的第3代通過流式細胞儀鑒定干細胞表面標記。將hUC-MSC用0.25%胰酶消化,PBS重懸,制備1×106/ml的細胞懸液。然后取100 μl的細胞懸液與20 μl的FITC標記的一抗(CD29、CD34、CD45、CD90、CD105和IgG)4 ℃避光孵育1 h,通過Beckman Coulter流式細胞儀檢測細胞的免疫熒光。

1.5 細胞增殖測定

用MTT法測定hUC-MSC的增殖能力。按照試劑盒說明,將1×104細胞在96孔板中培養(yǎng)48 h,用100 μl無菌MTT(0.5 mg/ml)在37 ℃染色4 h,除去培養(yǎng)基并加入150 μl二甲基亞砜,測量490 mm處的吸光度。

1.6 miR-140-5p過表達慢病毒轉(zhuǎn)染

用Lipofectamine 2000將pLenO-DCE-Puro-miR-140-5p和空慢病毒共同轉(zhuǎn)染293T細胞8 h,PBS洗滌3次,用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h,每天觀察綠色熒光蛋白。收集轉(zhuǎn)染的293T細胞上清液并在4 000 r/min離心15 min,收集上清液并用0.45 μm微孔濾膜過濾,將濾液在25 000 r/min離心1 h,收集病毒沉淀并重懸于500 μl DMEM培養(yǎng)基中,4 ℃溶解過夜,將溶解后的病毒用EP管分裝并置于-80 ℃保存。含miR-140-5p的重組慢病毒懸液的滴度為2×108TU/ml,對照慢病毒的滴度為1×109TU/ml。將hUC-MSC分為3組:感染組(過表達miR-140-5p組)、空病毒組和對照組。將P3代hUC-MSC按1×105/孔接種于6孔板中過夜培養(yǎng),感染組按照10 μl/孔加入重組慢病毒,空病毒組按照2 μl/孔加入空病毒,對照組未處理。另外,在每孔加入Polybrene儲液(終濃度為10 μg/μl),加入培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。之后用相同感染方式再次感染細胞,感染24 h時換液,72 h時收集細胞。

1.7 骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立及處理

將60只雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、空病毒組和過表達miR-140-5p的重組慢病毒組(miR-140-5p組),每組15只。戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,切斷大鼠右膝關(guān)節(jié)的前交叉韌帶建立骨關(guān)節(jié)炎模型[14]。模型組、空病毒組和miR-140-5p組大鼠進行建模,假手術(shù)組大鼠進行相同的手術(shù)操作,但不切斷前交叉韌帶。建模后第29天(4周后的第1天),空病毒組和miR-140-5p組大鼠在麻醉狀態(tài)下用30G針將50 μl空病毒或過表達miR-140-5p的重組慢病毒感染的hUC-MSC(1×106個細胞)注入關(guān)節(jié)腔內(nèi),假手術(shù)組和模型組注射等體積PBS。共給藥8周,每周注射3次。

1.8 番紅O-固綠染色和OARSI評分

給藥后第57天(給藥8周后的第1天),用4%多聚甲醛固定大鼠膝關(guān)節(jié),石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,脫蠟水合并按照生產(chǎn)商說明用番紅O-固綠染色染色以檢查膝關(guān)節(jié)軟骨的破壞情況。通過國際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(OARSI)評分[15]評估各組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨損傷程度。

1.9 RT-PCR檢測mRNA水平

給藥后第57天(給藥8周后的第1天),分離大鼠軟骨組織并在液氮中研磨,根據(jù)試劑盒說明書,用Trizol試劑提取大鼠軟骨組織的總RNA。用1 μg總RNA和PrimeScriptTMRT試劑盒通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。用SYBR Premix Ex Taq在Applied Biosystems 7500實時PCR系統(tǒng)上進行RT-PCR。GAPDH和U6分別用作目的基因和miR-140-5p表達的內(nèi)部對照。通過2-ΔΔCt方法分析RNA的相對表達。每個實驗至少重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.10 Western blot檢測SOX9、collagen Ⅱ、Aggrecan、NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5蛋白表達水平

在含1% Nonidet P-40、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl和0.1% SDS(含蛋白酶抑制劑)的緩沖液(pH 7.4)中裂解大鼠軟骨組織,將蛋白質(zhì)溶液在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min,以除去沉淀物。將變性的蛋白質(zhì)溶液進行10% SDS-PAGE分離,電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下用5% BSA封閉1 h,將膜與一抗在4 ℃孵育過夜。一抗如下所示:SOX9(1 ∶1 000)、collagen Ⅱ(1 ∶1 000)、Aggrecan(1 ∶1 000)、NLRP3(1 ∶1 000)、caspase-1(1 ∶1 000)、MMP13(1 ∶1 000)、ADAMTS-5(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 000)。二抗是HRP標記的山羊抗兔IgG(1 ∶1 000)。使用Pierce ECL化學(xué)發(fā)光液進行顯影。通過使用Image J軟件將條帶強度標準化為GAPDH。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,符合正太分布的數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。通過t檢驗或單因素方差分析及LSD事后檢驗比較組間差異。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSC的鑒定結(jié)果

觀察分離培養(yǎng)的第3代(P3)hUC-MSC形態(tài),結(jié)果見圖1。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,P3代hUC-MSC的表面標志物CD29表達率98.13%、CD90表達率98.92%、CD105表達率95.03%為高表達;造血干細胞表面標志物CD34表達率1.17%和CD45表達率0.96%為低表達(見圖2)。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察第3代hUC-MSC形態(tài) (×100)Figure 1 Morphology of the 3rd generation hUC-MSC under inverted phase contrast microscope (×100)

圖2 P3代hUC-MSC的表面標記物Figure 2 Surface markers of third generation hUC-MSC

分別在成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)hUC-MSC細胞來考察成骨和成脂分化潛能,油紅O染色結(jié)果證實hUC-MSC可分化為脂肪細胞,茜素紅染色證實細胞可分化為骨細胞,hUC-MSC具備多向分化潛能(見圖3)。

圖3 茜素紅和油紅O染色檢測hUC-MSC的成骨和脂肪分化能力 (×100)Figure 3 Abilities of osteogenic and adipogenic differentiation of hUC-MSC by Alizarin red and oil red O staining (×100)

2.2 miR-140-5p對hUC-MSC增殖的影響

應(yīng)用過表達miR-140-5p的重組慢病毒轉(zhuǎn)染的hUC-MSC(感染組)中miR-140-5p表達水平顯著高于對照組和空病毒組(P<0.05)。然而,感染組、空病毒組和對照組的細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖4)。

與對照組和空病毒組比較,*P<0.05圖4 miR-140-5p在hUC-MSC中的表達及對hUC-MSC增殖的影響Figure 4 Expression of miR-140-5p in hUC-MSC and its effect on hUC-MSC proliferation

2.3 過表達miR-140-5p的hUC-MSC對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨退變的影響

假手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨和骨結(jié)構(gòu)完整,而模型組的番紅O失染嚴重,關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生明顯結(jié)構(gòu)破壞;空病毒組也存在番紅O失染,但失染程度低于模型組;過表達miR-140-5p的hUC-MSC治療的大鼠(miR-140-5p組)的番紅O失染情況明顯好轉(zhuǎn)(見圖5)。模型組大鼠的OARSI評分顯著高于假手術(shù)組,而空病毒組和miR-140-5p組OARSI評分均顯著低于模型組,并且miR-140-5p組低于空病毒組(P<0.05,見圖5)。

2.4 過表達miR-140-5p的hUC-MSC對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織中軟骨分化標志基因表達的影響

基因表達結(jié)果顯示,模型組大鼠軟骨組織中的miR-140-5p表達水平明顯低于假手術(shù)組,miR-140-5p組miR-140-5p表達水平明顯高于其他組(P<0.05)。與假手術(shù)組相比,模型組的軟骨分化標志基因collagen Ⅱ(COL2A1)、Aggrecan和SOX9的表達水平均顯著降低,空病毒組和miR-140-5p組的collagen Ⅱ(COL2A1)、Aggrecan和SOX9的表達水平均顯著高于模型組,并且miR-140-5p組顯著高于空病毒組(P<0.05,見圖6)。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與空病毒組比較,&P<0.05B.各組大鼠膝關(guān)節(jié)的OARSI評分圖5 過表達miR-140-5p的hUC-MSC對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨退變的影響Figure 5 Effect of hUC-MSC overexpressing miR-140-5p on cartilage degeneration of rats

圖6 大鼠軟骨組織中miR-140-5p、collagen Ⅱ(COL2A1)、Aggrecan和SOX9的mRNA或蛋白表達Figure 6 The mRNA or protein expression of miR-140-5p, collagen Ⅱ(COL2A1), Aggrecan, and SOX9 in cartilage tissue of rats

2.5 過表達miR-140-5p的hUC-MSC對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織中炎癥因子表達的影響

與假手術(shù)組相比,模型組的軟骨組織中炎癥因子NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05),空病毒組和miR-140-5p組的NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5的mRNA和蛋白表達水平均顯著低于模型組,并且miR-140-5p組的炎癥因子表達水平均顯著低于空病毒組(P<0.05,見圖7)。

圖7 大鼠軟骨組織中NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5的mRNA或蛋白表達Figure 7 The mRNA or protein expression of NLRP3, caspase-1, MMP13 and ADAMTS-5 in cartilage tissue of each group of rats

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨損傷會降低其自我修復(fù)功能,提高關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)功能是治療骨關(guān)節(jié)炎的新策略。大量研究證實,干細胞具有分化潛能和抗炎功能,干細胞療法近年來已成為治療骨關(guān)節(jié)炎的新型治療方法[16]。間充質(zhì)干細胞存在于人體的各種組織中,如骨髓、脂肪組織、臍帶組織、臍帶華通膠、韌帶等,并且間充質(zhì)干細胞具有不同的增殖和分化潛能[17]。

目前治療骨關(guān)節(jié)炎的干細胞療法主要是脂肪來源的干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞,關(guān)于臍帶間充質(zhì)干細胞方面的研究較少。與其他來源的間充質(zhì)干細胞相比,來源于臍帶華通膠的間充質(zhì)干細胞在骨關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)方面具有多種優(yōu)勢。首先,新生兒臍帶標本豐富,因此可提供大量的hUC-MSC。其次,hUC-MSC的收集過程中不會對個體造成創(chuàng)傷或疼痛。再次,hUC-MSC增殖較快并且無致瘤性[18]。另外,hUC-MSC具有更高的可誘導(dǎo)性[19]。基于上述優(yōu)勢,hUC-MSC在治療骨關(guān)節(jié)炎方面的應(yīng)用前景廣闊。

多項研究已證明,micro RNA(例如miR-140、miR-146、miR-27b)在軟骨形成中起積極作用,并且其表達水平隨著骨關(guān)節(jié)炎的進展而逐漸減少[20]。有研究表明,關(guān)節(jié)內(nèi)注射miRNA-140可通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)(ECM)穩(wěn)態(tài)來減弱大鼠骨關(guān)節(jié)炎的進展[21]。其他研究者提出,miR-140-5p是軟骨形成中的關(guān)鍵正調(diào)控因子,其可靶向調(diào)控MMP13、ADAMTS5、SOX9等基因來抑制炎癥和促進軟骨形成,其在預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎方面具有較高的潛力[11]。

本研究應(yīng)用過表達miR-140-5p的重組慢病毒轉(zhuǎn)染hUC-MSC,研究表明轉(zhuǎn)染后hUC-MSC中的miR-140-5p表達水平顯著升高。先前的研究報道m(xù)iR-140可以誘導(dǎo)軟骨細胞增殖[22],但在本研究中hUC-MSC的增殖能力未受到影響。其原因可能是由于miRNA具有協(xié)同干細胞增殖和分化平衡的作用,Liu等[23]證明miR-184控制著成年神經(jīng)干細胞的增殖與分化之間的平衡。因此,miR-140-5p的過表達可能不會直接促進hUC-MSC的增殖,但可能促進了軟骨分化。

本研究中番紅O固綠染色和OARSI評分顯示,空病毒轉(zhuǎn)染的hUC-MSC和過表達miR-140-5p的慢病毒轉(zhuǎn)染的hUC-MSC均明顯抑制了骨關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨退變,并且過表達miR-140-5p的hUC-MSC的治療效果更好。胡瓊英等[24]應(yīng)用人臍帶血間充質(zhì)干細胞治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠,研究表明治療后小鼠臨床癥狀明顯改善,促炎因子表達水平顯著降低。曹娟等[25]應(yīng)用臍帶間質(zhì)干細胞干預(yù)后的骨關(guān)節(jié)炎新西蘭大白兔模型,研究顯示干預(yù)后兔滑膜增厚、關(guān)節(jié)積液等病變情況顯著改善,軟骨及滑膜炎性細胞浸潤減輕,IL-6、MMP-13等炎癥因子表達水平顯著降低。上述研究說明臍帶血間充質(zhì)干細胞對關(guān)節(jié)炎疾病具有一定的治療作用,而通過上調(diào)hUC-MSC中miR-140-5p的表達后,其治療效果得到很大程度的提升。其原因與miR-140-5p的抗炎和促進軟骨形成的作用密切相關(guān)[11]。

關(guān)節(jié)軟骨是一種膠原纖維構(gòu)成的軟骨,在關(guān)節(jié)活動中發(fā)揮緩沖壓力、承受力學(xué)負荷、潤滑、增加關(guān)節(jié)靈活性等重要作用。關(guān)節(jié)軟骨是一種專門的連接組織,其細胞外基質(zhì)主要由蛋白多糖aggrecan和collagen Ⅱ等大分子組成[26]。SOX9基因是對骨骼系統(tǒng)發(fā)育有重要影響的轉(zhuǎn)錄激活因子,可在軟骨前體細胞和軟骨細胞中表達,并且SOX9可通過調(diào)控aggrecan和collagen Ⅱ來影響軟骨的生成[27]。collagen Ⅱ(COL2A1)、Aggrecan和SOX9均是軟骨分化標志基因,而collagen Ⅱ和Aggrecan是SOX9的下游信號分子。當上述基因表達降低時說明軟骨細胞外基質(zhì)發(fā)生降解、軟骨組織受損。本研究顯示過表達miR-140-5p的hUC-MSC顯著上調(diào)了骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織中collagen Ⅱ(COL2A1)、Aggrecan和SOX9的表達,說明該干細胞療法可明顯提高骨關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨修復(fù)功能。

NLRP3炎癥體信號通路參與介導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程,其可調(diào)節(jié)促炎性細胞因子和降解酶的合成和釋放[28]。已有研究表明,兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨中NLRP3的表達水平顯著升高[29]。caspase-1是NLRP3的下游靶基因,不僅參與骨關(guān)節(jié)炎進展,而且可介導(dǎo)細胞凋亡和細胞焦亡。在MMPs組中,MMP-13是參與骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的主要酶,具有水解細胞外基質(zhì)collagen Ⅱ蛋白的作用[30,31]。ADAMTS-5是與關(guān)節(jié)疾病相關(guān)的聚集蛋白聚糖酶[32]。下調(diào)ADAMTS-5的表達會減弱由炎癥介質(zhì)刺激的軟骨細胞中aggrecan的降解,從而提供骨關(guān)節(jié)炎治療作用[33]。本研究結(jié)果表明,過表達miR-140-5p的hUC-MSC顯著抑制了骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織中NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5的表達,說明該干細胞療法的軟骨治療功能與其對上述炎癥相關(guān)因子的抑制有關(guān)。

綜上所述,通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射過表達miR-140-5p的hUC-MSC可顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨退變并提高軟骨修復(fù)功能;過表達miR-140-5p的hUC-MSC可通過抑制NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5的表達來發(fā)揮軟骨治療作用。