洪 剛,王 丹

(重慶開(kāi)州區(qū)人民醫(yī)院,重慶 405400)

近年來(lái)，腰椎間盤突出癥發(fā)病率受年齡及職業(yè)因素的影響而日漸升高，其病程長(zhǎng)，主要表現(xiàn)為局部腰痛及下肢放射性疼痛，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。神經(jīng)機(jī)械壓迫、炎癥刺激、血供障礙等是腰椎間盤突出癥主要發(fā)病機(jī)制，針刀療法對(duì)腰椎間盤突出癥患者療效確切，可利用鋒利刀刃對(duì)軟組織損傷處條索、硬結(jié)、粘連等進(jìn)行切割、剝離，恢復(fù)關(guān)節(jié)處力學(xué)平衡，同時(shí)結(jié)合了毫針針刺疏通損傷組織氣血，達(dá)到治療效果[2],而獨(dú)活寄生湯具有鎮(zhèn)痛、抗炎、改善血液循環(huán)等功效，也已逐步應(yīng)用于腰椎間盤突出癥的治療中[3]，但有關(guān)兩者聯(lián)合應(yīng)用的報(bào)道尚不多見(jiàn)，因此本研究旨在探究針刀療法與獨(dú)活寄生湯聯(lián)合應(yīng)用治療腰椎間盤突出癥大鼠的效果，分析其對(duì)背根神經(jīng)節(jié)炎癥的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

70只清潔級(jí)健康SD大鼠，雄性，8周齡，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：2001A046，大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，室溫25℃左右，自由進(jìn)水、進(jìn)食。

1.2 主要試劑

獨(dú)活寄生湯(購(gòu)于中國(guó)人民解放軍第202醫(yī)院藥局，藥方組成：獨(dú)活12 g，秦艽、杜仲、桑寄生、牛膝、細(xì)辛各9 g，防風(fēng)、干地黃、當(dāng)歸、茯苓、川芎、肉桂心、芍藥、人參各6 g，甘草3 g)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(金斯瑞生物科技有限公司)；碘伏消毒劑(北京百諾威生物科技有限公司)等。

1.3 主要儀器

9號(hào)腰椎穿刺針(上海埃斯醫(yī)械塑料制品有限公司)；一次性無(wú)菌HZ系列漢章針刀(北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司，0.4 mm×0.4 mm)；PL-200型熱痛測(cè)試儀(四川科儀誠(chéng)科技有限公司)；5810R型低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；JY-SCZ2180型垂直電泳槽(西安賽維斯生物科技有限公司)；NOVA型超薄切片機(jī)(瑞典LKB公司)；CX23型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；Q550圖像處理系統(tǒng)(德國(guó)LEICA公司)。

1.4 動(dòng)物模型構(gòu)建及分組

將70只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、獨(dú)活寄生湯組、針刀組、針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組，各14只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均構(gòu)建腰椎間盤突出癥大鼠模型[4]：術(shù)前1 d，于大鼠背部脫毛，以3.5 mL/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，距鼠尾根部1 cm處切斷鼠尾，切開(kāi)尾部椎間盤見(jiàn)髓核呈膠凍樣(約10 mg)，取5個(gè)髓核，1 mg髓核加1 μL生理鹽水，混勻制備自體髓核混懸液,大鼠取屈曲側(cè)臥位，以9號(hào)腰椎穿刺針于L4～5棘突間隙行硬膜外穿刺，注射20 μL自體髓核混懸液，于硬膜外腔注射30 μL 2%利多卡因；假手術(shù)組以20 μL生理鹽水替代大鼠自體髓核混懸液，其他操作均同上。待大鼠清醒后若雙前肢活動(dòng)自如，雙后肢運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)喪失或減退，30 min左右完全恢復(fù)即證明硬膜外穿刺成功，繼續(xù)觀察，若大鼠雙后肢無(wú)癱瘓，且兩側(cè)后足熱痛反應(yīng)出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏即證明模型制備成功。

1.5 各組動(dòng)物干預(yù)方法

1.5.1 獨(dú)活寄生湯組 建模3 d后開(kāi)始灌胃獨(dú)活寄生湯13.8 mg/kg，1次/d，連續(xù)灌胃2周；

1.5.2 針刀組 建模3 d后進(jìn)行針刀療法：將大鼠以自制襪套固定于鼠板上，于L4～5棘間、L4～5棘間旁開(kāi)0.1 cm處、患椎上下橫突及雙側(cè)坐骨神經(jīng)出口處以碘伏消毒，進(jìn)行針刀操作，均以HZ系列一次性針刀進(jìn)行針刀操作，①棘間：針刀刀口線方向與脊柱縱向軸方向一致，按四部規(guī)程刺入，待針刀有落空感(突破黃韌帶時(shí))微提針刀，稍加推進(jìn)；②橫突點(diǎn)：針刀刀口線方向與脊柱縱向軸方向一致，按四部規(guī)程刺入，松解完橫突后將針刀退至淺層，傾斜針刀從外到內(nèi)，由淺層向深層松解至橫突根部，待有落空感時(shí)將針刀刀口線微調(diào)為“八字形”，向里稍加推進(jìn)；③坐骨神經(jīng)出口處：針刀刀口方向與坐骨神經(jīng)走向一致，按四部規(guī)程刺入，待針刀有落空感時(shí)微提針刀然后稍加推進(jìn)，均以碘伏消毒，進(jìn)行針刀操作，以大鼠下肢觸電樣抽動(dòng)為度，3次/周，治療2周。

1.5.3 針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組 建模3 d后同時(shí)給予獨(dú)活寄生湯灌胃并施以針刀療法，方法同獨(dú)活寄生湯組及針刀組。

1.5.4 模型組及假手術(shù)組 建模后正常飼養(yǎng)。

1.6 大鼠熱痛刺激縮爪閾值

分別于干預(yù)前及干預(yù)2周后將各組大鼠置于PL-200型熱痛測(cè)試儀的檢測(cè)盒內(nèi)，加工熱光源通過(guò)儀器輻射到檢測(cè)盒底部玻璃板上并使其聚集至大鼠一側(cè)足底后半部分，光斑直徑5 mm，記錄從開(kāi)始照射至縮爪時(shí)間間隔，左右足交替測(cè)試3次，2次測(cè)試間隔5 min，取平均值[5]。

1.7 HE染色

觀察大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織病理變化,干預(yù)2周后待檢測(cè)大鼠熱痛刺激縮抓閾值結(jié)束后，將大鼠固定于鍘刀，端頭處死，迅速倒置，腹腔解剖，暴露并采集長(zhǎng)約2 mm的L5神經(jīng)根組織，于10%甲醛中固定24 h，常規(guī)制備厚約4 μm石蠟組織切片，進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理形態(tài)[6]。

1.8 ELISA法檢測(cè)大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織炎性因子含量

背根神經(jīng)節(jié)組織采樣同1.7，研磨、勻漿，并以生理鹽水按1:10比例進(jìn)行稀釋制備組織懸液，以ELISA法檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)組織中白細(xì)胞介素1(IL-1)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量[7]。

1.9 WB法檢測(cè)大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織炎性因子含量

背根神經(jīng)節(jié)組織采樣同1.7，提取組織總蛋白，經(jīng)BCA法定量，取50 μg進(jìn)行WB檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參，經(jīng)Q550圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)IL-1、TNF-α蛋白表達(dá)[8]。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠熱痛刺激縮爪閾值比較

模型組干預(yù)前及干預(yù)2周后熱痛刺激縮爪閾值均較假手術(shù)組縮短(P<0.05)；與模型組及干預(yù)前比較，干預(yù)2周后獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組大鼠熱痛刺激縮爪閾值均延長(zhǎng)，且針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組長(zhǎng)于獨(dú)活寄生湯組、針刀組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠熱痛刺激縮爪閾值比較

2.2 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理學(xué)形態(tài)觀察

HE染色顯示，假手術(shù)組小鼠背根神經(jīng)節(jié)組織細(xì)胞排列整齊，胞核位于中央，大且圓，核仁清晰，胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒樣尼氏小體；模型組細(xì)胞間隙距離增加，胞核固縮或偏移，胞質(zhì)溶解，呈空泡樣變，尼氏小體減少；獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組上述病理變化均有不同程度的減輕。見(jiàn)圖1。

注：A.假手術(shù)組; B.模型組; C.獨(dú)活寄生湯組; D.針刀組; E.針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組。圖1 HE染色觀察大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理?yè)p傷(200×)

2.3 ELISA法檢測(cè)各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)炎性因子含量

ELISA檢測(cè)顯示，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織IL-1、TNF-α含量較假手術(shù)組顯著升高，而獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組較模型組顯著降低，且針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組顯著低于獨(dú)活寄生湯組及針刀組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織IL-1及TNF-α含量比較

2.4 WB法檢測(cè)各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)炎性因子含量

WB檢測(cè)顯示，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織IL-1、TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量較假手術(shù)組顯著升高，而獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組較模型組顯著降低，且針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組顯著低于獨(dú)活寄生湯組及針刀組(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

注:A.假手術(shù)組; B.模型組; C.獨(dú)活寄生湯組; D.針刀組; E.針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組。圖2 WB法檢測(cè)大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織IL-1及TNF-α蛋白含量(200×)

表3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織IL-1及TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

腰椎間盤突出癥主要是由纖維環(huán)、髓核產(chǎn)生退行性變，纖維環(huán)破裂，髓核脫出，導(dǎo)致相鄰脊神經(jīng)根受刺激或壓迫所致[9-10]。其屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，風(fēng)、寒、濕、虛是其致病因素，而機(jī)體內(nèi)在的正虛是其發(fā)病的關(guān)鍵。獨(dú)活寄生湯最早記載于《備急千金要方》，主治風(fēng)寒濕痹，全方共奏祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎及補(bǔ)氣血之功，邪正兼顧，驅(qū)邪不傷正，扶正不留邪[10-11]。獨(dú)活寄生湯可有效調(diào)控腰椎間盤突出癥大鼠髓核組織及纖維環(huán)組織中MMP-1表達(dá)，抑制腰椎間盤退變，效果顯著；針刀療法整合了針刺療法及手術(shù)松解法，其利用“針刺”原理，疏通經(jīng)脈、行氣活血，并結(jié)合西醫(yī)“刀”的原理，松解粘連組織，解除擠壓，實(shí)現(xiàn)“以松致通、通則不痛”，可通過(guò)調(diào)節(jié)腰椎間盤突出癥大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織致痛因子表達(dá)，改善其局部微循環(huán)，進(jìn)而達(dá)到治療目的[12-14]。目前有關(guān)針刀療法結(jié)合獨(dú)活寄生湯共同治療腰椎間盤突出的效果尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究以腰椎間盤突出大鼠模型為研究對(duì)象，進(jìn)行初步探究。

腰椎間盤組織是機(jī)體最大的無(wú)血供組織，髓核因包裹于纖維環(huán)內(nèi)而與血液循環(huán)隔離，當(dāng)退行性病變或外傷導(dǎo)致椎間盤抗原與血液循環(huán)接觸后，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，釋放炎性介質(zhì)，誘發(fā)炎性病變，導(dǎo)致疼痛。針刀具有比普通毫針更強(qiáng)的針刺效應(yīng)及針感，刺激穴位及經(jīng)絡(luò)后可行氣活血、通經(jīng)止痛；同時(shí)還可刮除瘢痕，松解組織粘連，有利于吸收炎性介質(zhì)，消散炎性滲出，消除肌肉痙攣，恢復(fù)病變部位平衡，通利關(guān)節(jié)并改善關(guān)節(jié)功能。針刀療法能夠通過(guò)松解局部粘連改善腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛大鼠微循環(huán)、促進(jìn)炎癥因子代謝、緩解疼痛；而獨(dú)活寄生湯可抑制炎性因子生成， 減輕髓核所致炎性反應(yīng)，治療肝腎虧虛型腰椎間盤突出[15-16]。髓核脫出后可引發(fā)神經(jīng)根與背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)、功能變化，脊神經(jīng)根微循環(huán)與營(yíng)養(yǎng)障礙是腰椎間盤突出癥的主要致痛機(jī)制[17]。本研究結(jié)果顯示，獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理?yè)p傷均較模型組有所改善。提示針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯可有效改善腰椎間盤突出癥大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理?yè)p傷；此外本研究結(jié)果顯示，干預(yù)2周后獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組大鼠熱痛刺激縮爪閾值均較模型組延長(zhǎng)，且針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組長(zhǎng)于獨(dú)活寄生湯組及針刀組；此外，獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織IL-1、TNF-α含量及其蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組顯著降低，且針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組顯著低于獨(dú)活寄生湯組及針刀組。提示針刀療法配合獨(dú)活寄生湯可有效降低腰椎間盤突出癥大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織炎性細(xì)胞因子含量，有效緩解其炎性損傷，緩解疼痛。

綜上，針刀療法配合獨(dú)活寄生湯可有效降低腰椎間盤突出癥大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織炎性因子含量，改善其組織病變，進(jìn)而明顯提高大鼠熱痛刺激縮爪閾值，減輕疼痛，具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，治療效果顯著，但有關(guān)其具體分子作用機(jī)制及獨(dú)活寄生湯的最佳應(yīng)用劑量尚需進(jìn)一步系統(tǒng)研究。