周海純，韓曉慶，郭蕊珠，蔡國鋒,4△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院哈南分院，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.哈爾濱市急救中心，黑龍江 哈爾濱 150001; 4.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

中風(fēng)具有很高的致殘率，嚴(yán)重影響了個人生活，并且在一定程度上阻礙社會經(jīng)濟的發(fā)展。近年來，大量學(xué)者對中風(fēng)病深入研究，筆者查閱大量文獻(xiàn)，經(jīng)過系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)中風(fēng)病9種體質(zhì)治病原因，歷經(jīng)10余年對其進(jìn)行大量研究，依據(jù)神經(jīng)元再生理論，探討中風(fēng)后神經(jīng)干細(xì)胞變化。大量文獻(xiàn)及研究記載針刺治療中風(fēng)病效果顯著[1]。依據(jù)中醫(yī)理論，針刺可以刺激腧穴，疏通經(jīng)絡(luò)，提高人體調(diào)整能力，從而使人體最大限度的接近陰陽平衡的平和質(zhì)狀態(tài)，激發(fā)自身潛能，修復(fù)中風(fēng)損傷。近年來已經(jīng)取得了西醫(yī)界廣泛認(rèn)同，研究證實針刺能夠有效的調(diào)動內(nèi)源性保護機制。

頭腹針療法作為針刺療法的一種，由于痛苦小、操作簡便、作用顯著，近年來在臨床普遍應(yīng)用，在治療中風(fēng)臨床方面已經(jīng)有大量學(xué)者就其理論機制等進(jìn)行了大量研究，具有較好的前期研究基礎(chǔ)，驗證了頭腹針療法的治療效果，但查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，其實驗研究內(nèi)容相對較少，同時對頭腹針療法治療中風(fēng)的研究很少依據(jù)中醫(yī)理論采取辨證分型。本實驗研究將頭腹針療法作為治療方法，辨證分型將氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)作為研究疾病，參考文獻(xiàn)制備氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型，從宏觀神經(jīng)功能及行為學(xué)功能變化、微觀Hes1蛋白、基因變化對神經(jīng)元再生的影響，探討頭腹針療法治療中風(fēng)的作用機制，望為頭腹針療法臨床治療氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(300±20)g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供[動物實驗許可證編號：SCXK(黑)2019-001]。

1.2 主要儀器和試劑

普通光學(xué)顯微鏡(Japan OLYMPUS company)；Bio-Rad核酸和蛋白電泳系統(tǒng)(美國 BIO-RAD伯樂公司)；電子嬰兒秤(青島艾訊電子衡器有限公司)；凝膠成像分析儀(無錫百泰克生物科技)；Bio-Rad核酸擴增PCR儀(廣州杰特偉生物科技有限公司)；NanoDrop ND-1000濃度分析儀(Thermo,上海創(chuàng)萌生物科技有限公司)；恒溫水浴鍋(上海一科儀器有限公司);4℃低溫離心機、上海電熱恒溫干燥箱(上海東麓儀器設(shè)備有限公司);抗體：兔抗人Hes1多克隆抗體(cam公司，#5702);β-Actin (13E5)Rbit m (CST公司，貨號#4970)等。

1.3 模型制備及篩選方法

實驗造模分為兩個階段，首先所有大鼠進(jìn)行氣虛質(zhì)造模，成功后隨機分為模型組、治療組，每組15只模型大鼠，通過MCAO造模，選取合格模型予神經(jīng)功能及行為學(xué)功能評分;另外10只為假手術(shù)組，不進(jìn)行MCAO造模操作。

1.3.1 氣虛質(zhì)造模 第一步：飲食飲水量控制。鼠糧喂養(yǎng)方式以2 d無喂養(yǎng)與1 d正常喂養(yǎng)交替方式進(jìn)行，8:30為供給鼠糧時間。飲食量控制參照公式:(供給鼠糧量-剩余鼠糧量)/實驗大鼠數(shù)量；飲水量控制參照公式:(供給飲水量-剩余飲水量)/實驗大鼠數(shù)量。

第二步：睡眠剝奪。隔日1次將大鼠置于跑臺跑道內(nèi)，以1 m/min跑臺速度方式制造不穩(wěn)定平面，每次持續(xù)時間24 h，對實驗大鼠睡眠剝奪。每周對實驗大鼠進(jìn)行記錄1次，記錄內(nèi)容為體質(zhì)量、體溫、攝食量、飲水量、抓力，其中對實驗大鼠體溫及抓力的記錄取3次平均值，實驗過程持續(xù)時間28 d[2]。

1.3.2 MCAO造模 氣虛質(zhì)中風(fēng)大鼠模型成功后，予氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型造模，手術(shù)方式依據(jù)目前公認(rèn)的Zea Longa等建立的大腦中動脈阻塞術(shù)(MCAO) ，對氣虛質(zhì)中風(fēng)大鼠實行大腦中動脈內(nèi)栓線阻斷法建造氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 模型組 術(shù)后不予任何治療。

1.4.2 治療組 采用針刺操作。取穴：頭部采用頭穴叢刺長留針法針刺，依據(jù)“大鼠穴位圖譜”選擇頂區(qū)及頂前區(qū)穴位[3]。腹針療法引氣歸元腧穴取中脘、下脘、氣海和關(guān)元。依據(jù)大鼠穴位的定位常用“比較解剖取穴法”“模擬骨度法”，在大鼠的腹中線上，以胸劍聯(lián)合為定位點，以恥骨聯(lián)合上緣為另一定位點，兩者連線的上8/13與下5/13的交點定位為神闕穴;中脘:兩者連線的上4/13與下9/13的交點; 下脘:兩者連線的上6/13與下7/13的交點;關(guān)元:兩者連線的上10/13與下3/13的交點;氣海:神闕與關(guān)元中點處。

操作：在鼠板上固定氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)模型大鼠，選取0．25 mm×15 mm華佗牌無菌針灸針，腹針在中脘、下脘、氣海和關(guān)元穴位直刺2 mm，每日1次，每次留針30 min;頭針刺入深度為沿皮平刺大約3 mm，每日1次，每次留針5 h[3]。

1.4.3 假手術(shù)組 對實驗大鼠單純動脈剝離即可。

1.5 腦組織取材

將模型組、治療組氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)模型剩余大鼠分成3批，分別于針刺3 d、7 d及14 d取材。使用EP管保留標(biāo)本組織。使用儲存設(shè)備選擇-80℃超低溫儀器。

1.6 評價方法

1.6.1 神經(jīng)功能評定 造模成功24 h后，在療前、療后7 d及療后14 d 3個時間節(jié)點對氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型評分，并記錄，評分依據(jù)為Bederson 4級評分標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.6.2 行為學(xué)功能測驗 包括網(wǎng)屏測驗(screentest)、平衡木測驗(balancebeamtest)、抓握-牽引測驗(prehensile-tractiontest)[5]。見表1。

表1 行為學(xué)功能評分標(biāo)準(zhǔn)

1.6.3 PCR檢測 引物設(shè)計與常規(guī) PCR擴增根據(jù)GenBank已發(fā)表的大鼠Hes1序列和β-Actin的序列，應(yīng)用Premier5.0設(shè)計引物[6]。見表2。

表2 實驗中所使用的引物序列

1.6.4 Western Blot檢測 Western Blot[7]:第一步：蛋白的膜轉(zhuǎn)移;第二步：篩選對應(yīng)抗體;第三步：樣品蛋白檢測。操作：蛋白質(zhì)膜上轉(zhuǎn)移;檢測：已知表達(dá)蛋白，抗體檢測;檢測：采用融合部分的抗體針對新基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能評定比較

表3顯示,模型組及治療組均表現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，在治療前模型組與治療組神經(jīng)功能缺損評分無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明治療前模型組與治療組氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型神經(jīng)功能缺損程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義;頭腹針療法治療第7天、第14天后，治療組神經(jīng)功能評定明顯改善，推斷氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型神經(jīng)元的數(shù)量提高,同時模型組氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠神經(jīng)功能缺損在一定程度上也表現(xiàn)改善，分析原因氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠腦組織自身具有較強的代償修復(fù)能力;通過統(tǒng)計學(xué)結(jié)果可以看出，治療組神經(jīng)功能評定第7天、第14天與模型組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明頭腹針療法治療氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型第7天、第14天后，可以有效干預(yù)大鼠神經(jīng)功能狀態(tài)。21 d大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 各組神經(jīng)功能評定比較

2.2 各組行為學(xué)檢查比較

表4顯示,在治療前模型組與治療組氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型行為學(xué)功能缺損評分比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明治療前模型組與治療組大鼠行為學(xué)功能缺損程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義;頭腹針療法治療第7天、第14天后，治療組行為學(xué)明顯改善，推斷氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型神經(jīng)元的數(shù)量提高,同時模型組氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠行為學(xué)功能缺損在一定程度上也表現(xiàn)改善，分析原因氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠腦組織自身具有較強的代償修復(fù)能力;通過統(tǒng)計學(xué)結(jié)果可以看出，治療組氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型行為學(xué)功能評定第7天、第14天與模型組比較均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明頭腹針療法治療氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型第7天、第14天后，可以有效干預(yù)大鼠行為學(xué)功能狀態(tài)。21 d大鼠行為學(xué)功能恢復(fù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 各組行為學(xué)比較

2.3 各組Hes1 mRNA比較

表5、表6和圖1顯示,神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中， 假手術(shù)組Hes1 mRNA在3 d、7 d和14 d無明顯陽性表達(dá)，各時間點陽性表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);模型組Hes1 mRNA在3 d、7 d和14 d具有一定陽性表達(dá)，并且14 d陽性表達(dá)>7 d陽性表達(dá)>3 d陽性表達(dá)，說明氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠在腦損傷后具有較強的自我修復(fù)能力；治療組Hes1 mRNA陽性表達(dá)在3 d、7 d和14 d各時間點均表現(xiàn)明顯，并且14 d陽性表達(dá)>7 d陽性表達(dá)>3 d陽性表達(dá);治療組Hes1 mRNA陽性表達(dá)與模型組比較，在第3天陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明頭腹針療法治療對于氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠的腦損傷后Hes1 mRNA表達(dá)在第3天可能不具有明顯干預(yù)作用;第7天治療組Hes1 mRNA陽性表達(dá)與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明頭腹針療法治療對于氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠腦損傷后Hes1 mRNA表達(dá)在連續(xù)治療7 d后具有明顯干預(yù)作用;第14天治療組Hes1 mRNA陽性表達(dá)與模型組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明頭腹針療法治療對于氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠腦損傷后Hes1 mRNA表達(dá)在連續(xù)治療14 d具有極明顯干預(yù)作用，同時連續(xù)治療14 d干預(yù)作用優(yōu)于連續(xù)治療7 d。21 d大鼠痊愈，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明大鼠具有很強的自身恢復(fù)能力。

表5 Hes1和β-Actin引物設(shè)計及驗證

圖1 PCR檢測測定腦組織Hes1 mRNA表達(dá)

表6 PCR檢測測定腦組織Hes1 mRNA表達(dá)比較

2.4 各組Hes1蛋白比較

表7、圖2顯示,神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中， 假手術(shù)組Hes1蛋白在3 d、7 d和14 d無明顯陽性表達(dá)，各時間點陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05);模型組Hes1蛋白在3 d、7 d未見明顯陽性表達(dá)，14 d可以觀測到陽性表達(dá)，但很微弱；治療組Hes1蛋白陽性表達(dá)在3 d、7 d各時間點均不明顯，僅在14 d可見明顯陽性表達(dá);治療組Hes1蛋白陽性表達(dá)與模型組比較，第3天、第7天差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),說明頭腹針療法治療對于氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠的腦損傷后Hes1蛋白表達(dá)在第3天、第7天兩個時間點可能不具有明顯干預(yù)作用，在第14天治療組Hes1蛋白陽性表達(dá)與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明頭腹針療法治療對于氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠的腦損傷后Hes1蛋白表達(dá)在連續(xù)治療14 d具有明顯干預(yù)作用。21 d大鼠痊愈，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明大鼠具有很強的自身恢復(fù)能力。

圖2 腦組織Hes1蛋白表達(dá)

表7 腦組織Hes1蛋白表達(dá)比較

3 討論

目前研究已經(jīng)證實Notch信號通路的 “旁側(cè)抑制” 作用對神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖具有干預(yù)作用[8]。Hes 是bHLH基因家族成員之一，是Notch信號的靶基因，在不同時期分別參與祖細(xì)胞的分屬及干細(xì)胞的分化，其效應(yīng)物 Hes1通過Notch信號通路抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，因此本實驗選擇Hes1蛋白、基因作為觀測指標(biāo)，能有效的分析頭腹針療法治療對于氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠在腦損傷后的作用機制[9]。

頭腹針療法治療中風(fēng)歷史悠久，近代臨床研究明確，經(jīng)絡(luò)學(xué)中背為陽、腹為陰，腹部同時有陽經(jīng)及陰經(jīng)循行，有陰中之陰的任脈可以調(diào)陰，足陽明胃經(jīng)和足少陽膽經(jīng)兩條陽經(jīng)，因此還可以調(diào)陽[10]。有帶脈束腰聯(lián)絡(luò)奇經(jīng)八脈。人體十二經(jīng)脈、奇經(jīng)八脈緊密聯(lián)系腹部與全身，同時在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷深入研究下，腦腸肽理論逐漸得到眾多醫(yī)家的重視。腦腸肽是指既存在于胃腸道系統(tǒng)，又存在于腦中的肽類物質(zhì)的統(tǒng)稱，該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步從生理角度證實了腦與胃腸道之間的聯(lián)系。在發(fā)現(xiàn)腦腸肽之前，就有醫(yī)家發(fā)現(xiàn)腸與腦之間存在著聯(lián)系并提出了腦腸軸理論。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)腦腸肽對于腦腸軸的科學(xué)運行具有主導(dǎo)作用。腦腸軸的信息主要通過神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和腸道菌群進(jìn)行傳遞。腦腸軸在大腦和胃腸道之間是一個雙向調(diào)節(jié)的通路，大腦的活動可以影響胃腸道，胃腸道的功能也可對大腦產(chǎn)生影響。

目前有研究表明胃腸道內(nèi)的微生物菌群可以通過感染、免疫途徑及內(nèi)分泌系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)人體的血壓、血糖、血脂，同時腸道菌群代謝產(chǎn)物氧化三甲胺也會影響膽汁酸和膽固醇的代謝，并且能夠使血小板大量聚集從而導(dǎo)致動脈硬化的產(chǎn)生[11]。而動脈硬化又是導(dǎo)致中風(fēng)的主要原因。同時近年來有研究證實腹部是人類的第二大腦，即腹腦學(xué)說及腦腸肽理論。根據(jù)孫氏腹針療法理論認(rèn)為，腹部存在著一個完整的神經(jīng)系統(tǒng)，其相當(dāng)于人的第二大腦，腹部是大腦的全息影像[12]。針刺腹部能夠促進(jìn)或改善大腦的功能。此為頭腹針療法治療主要理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果證實頭腹針療法治療第7天、第14天兩個時間節(jié)點，治療組大鼠神經(jīng)功能及行為學(xué)均得到明顯改善，提示頭腹針療法治療可以干預(yù)改善氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型神經(jīng)功能及行為學(xué)，從而推斷頭腹針療法治療可以促進(jìn)氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠模型神經(jīng)元的數(shù)量增加。在第14天治療組Hes1 mRNA陽性表達(dá)與模型組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，治療組Hes1蛋白陽性表達(dá)與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明頭腹針療法治療可以干預(yù)氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠腦損傷后Hes1 mRNA及Hes1蛋白表達(dá)，提示頭腹針療法治療在一定程度上可以干預(yù)氣虛質(zhì)缺血性中風(fēng)大鼠腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化。