李利華,郭豫梅
(陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,陜西 漢中 723000)
白豆蔻,為芭蕉目姜科豆蔻屬植物白豆蔻的果實(shí),可藥食兼用。中醫(yī)認(rèn)為,白豆蔻性溫、味辛,歸肺、脾胃經(jīng),有溫中止嘔、化濕行氣的功效,常用來治療濕阻所滯、脾胃不和、脘腹脹滿、不思飲食等[1,2]?,F(xiàn)代研究表明,白豆蔻中含有揮發(fā)油、精油、萜烯類化合物等物質(zhì),具有抑菌、平喘、芳香健胃、驅(qū)風(fēng)等多種藥理作用[3,4]。
黃酮類化合物是指以C6—C3—C6為基本碳架的一系列化合物,其基本母核為2-苯基色原酮[5]。黃酮類化合物廣泛存在于自然界植物體中,因其有較多的藥用功效[6,7],已成為天然藥物的研究熱點(diǎn)之一。目前對白豆蔻的研究主要集中在白豆蔻揮發(fā)油[8,9],對于白豆蔻黃酮類化合物的研究較少,僅有朱云霞等利用高速逆流色譜從白豆蔻中分離出5-羥基-3,7,4′-三甲氧基黃酮[10],而對于白豆蔻總黃酮的提取尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)以乙醇為溶劑提取白豆蔻中的總黃酮類化合物,通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化總黃酮的提取工藝條件,并通過對羥基自由基(·OH)的清除及超氧陰離子自由基(O2-·)的清除,考察白豆蔻總黃酮的抗氧化活性,為白豆蔻總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。
白豆蔻:購于當(dāng)?shù)厮幉氖袌?;將白豆蔻洗凈,低溫烘干,粉碎備用?/p>
蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:優(yōu)級純;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、鄰苯三酚等:以上試劑均為國產(chǎn)分析純。
UV型紫外-可見分光光度計 日本島津儀器公司;TDL-9001型光電分析天平 北京梅特勒精密儀器公司;PHS-3C 酸度計 北京賽多利斯儀器有限公司;SHB-III循環(huán)水式真空泵 開封宏興科教儀器廠。
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[11]。配制一系列不同濃度梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別顯色后于510 nm處測定吸光度值,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=5.342C-0.208,R=0.9979,其中C為蘆丁濃度(mg/mL),A為對應(yīng)的吸光度值。
1.2.2 白豆蔻總黃酮的提取及總黃酮含量的測定
準(zhǔn)確稱取白豆蔻粉末3.00 g,按照一定的料液比(g/mL)加入提取劑乙醇,設(shè)定一定的提取溫度和提取時間浸提白豆蔻總黃酮,抽濾,即得白豆蔻總黃酮提取液。
精密吸取定容好的溶液提取2.00 mL于25 mL容量瓶中,按照1.2.1的方法顯色后,在510 nm處測定溶液的吸光度,計算白豆蔻總黃酮提取率。
白豆蔻總黃酮提取率(%)=(測得總黃酮濃度×溶液體積×稀釋倍數(shù))/干樣品質(zhì)量。
1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)
以提取率為衡量指標(biāo),分別考察乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)、提取溫度(40,50,60,70,80 ℃)、提取時間(20,40,60,80,100 min)對白豆蔻總黃酮提取率的影響效果,篩選出各因素的最優(yōu)水平區(qū)間,每個處理做3份平行。
1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計
根據(jù)各單因素實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選結(jié)果,設(shè)計四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),利用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表優(yōu)化白豆蔻總黃酮提取工藝,正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。
表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment
1.2.5 白豆寇總黃酮抗氧化性能實(shí)驗(yàn)
參照文獻(xiàn)[12,13]的方法并略有改動。以Vc為陽性對照品,考察白豆蔻總黃酮對羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除能力。
2.1.1 乙醇濃度對白豆蔻總黃酮提取率的影響結(jié)果
圖1 乙醇濃度對提取率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction rate
由圖1可知,乙醇濃度在40%~60%內(nèi),白豆蔻總黃酮提取率隨乙醇濃度的增加呈上升趨勢,當(dāng)乙醇濃度為60%時提取率最高,為2.41%,而當(dāng)乙醇濃度高于60%后,白豆蔻總黃酮提取率逐漸下降,這可能是因?yàn)橐掖紳舛仍礁?,醇溶性雜質(zhì)、色素及親脂性強(qiáng)的組分浸出量會增加,導(dǎo)致黃酮類化合物提取率下降。因此,乙醇濃度選擇60%左右最佳。
2.1.2 料液比對白豆蔻總黃酮提取率的影響結(jié)果
圖2 料液比對提取率的影響Fig.2 The effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate
由圖2可知,料液比在1∶20~1∶40內(nèi),隨著料液比的增大,白豆蔻總黃酮提取率明顯上升,當(dāng)料液比為1∶40時提取率最高,為2.26%,而當(dāng)料液比大于1∶40后,白豆蔻總黃酮提取率有所下降。這可能是因?yàn)檫m當(dāng)增大提取劑用量有利于白豆蔻總黃酮的溶出,但提取劑用量過大,一方面總黃酮的溶出已達(dá)飽和,另一方面其他雜質(zhì)成分的溶出會增多,增加了后續(xù)濃縮、分離純化的負(fù)擔(dān)。因此,料液比選擇1∶40左右最佳。
2.1.3 提取溫度對白豆蔻總黃酮提取率的影響結(jié)果
圖3 提取溫度對提取率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the extraction rate
由圖3可知,提取溫度在40~80 ℃范圍內(nèi),隨著溫度的升高白豆蔻總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢,70 ℃時總黃酮提取率達(dá)最大值,為2.38%,當(dāng)提取溫度高于70 ℃時,白豆蔻總黃酮提取率有所下降;這可能是因?yàn)檫^高的溫度會引起黃酮分子發(fā)生裂解,使得提取率降低。因此,提取溫度選擇70 ℃左右最佳。
2.1.4 提取時間對白豆蔻總黃酮提取率的影響結(jié)果
由圖4可知,提取時間在20~60 min范圍內(nèi),白豆蔻總黃酮提取率隨提取時間的延長逐漸增加,且在提取時間60 min時提取率最高,為2.32%,而當(dāng)提取時間超過60 min后,白豆蔻總黃酮提取率有所下降。可能的原因是長時間受熱會使已溶出的黃酮類化合物鍵斷裂,導(dǎo)致總黃酮提取率降低。因此,提取時間選擇60 min左右最佳。
圖4 提取時間對提取率的影響Fig.4 The effect of extraction time on the extraction rate
表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment
由表2可知,比較K值大小可得到白豆蔻總黃酮的最優(yōu)提取條件為A2B1C2D2,即:乙醇濃度60%,料液比1∶30 (g/mL),提取溫度70 ℃,提取時間60 min;由極差R值可得出4個因素對總黃酮提取的影響主次順序?yàn)锳(乙醇濃度)>C(提取溫度)>D(提取時間)>B(料液比)。
表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of verification experiment
由表3可知,在優(yōu)化得到的最佳工藝條件下,白豆蔻總黃酮平均提取率為2.82%,高于表2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計表中的9組提取率結(jié)果,RSD<1.65%,表明該工藝條件穩(wěn)定,可以作為白豆蔻總黃酮的提取工藝條件。
2.4.1 對·OH清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖5 白豆蔻總黃酮對·OH的清除作用Fig.5 The scavenging effect of total flavonoids from Amomum kravanh against·OH
由圖5可知,隨著白豆蔻總黃酮提取液濃度的增大,其對·OH的清除率逐漸升高,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)最大清除率為73.7%;與對照品Vc比較可知,Vc對·OH的最大清除率為90.1%,高于白豆蔻總黃酮,說明白豆蔻總黃酮對·OH具有一定的清除能力,但清除能力低于Vc對照品。
2.4.2 對O2-·清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖6 白豆蔻總黃酮對O2-·的清除作用Fig.6 The scavenging effect of total flavonoids from Amomum kravanh against O2-·
由圖6可知,隨著白豆蔻總黃酮提取液濃度的增大,其對O2-·的清除率逐漸升高,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)白豆蔻總黃酮對O2-·的最大清除率為87.8%,對照品Vc的最大清除率為90.3%;由此可知,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),白豆蔻總黃酮對O2-·的清除能力與Vc相當(dāng)。
本實(shí)驗(yàn)以乙醇為溶劑提取白豆蔻中的總黃酮,通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝;以羥基自由基清除率及超氧陰離子自由基清除率為指標(biāo),考察白豆蔻總黃酮的抗氧化性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,白豆蔻總黃酮的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度60%,料液比1∶30 (g/mL),提取溫度70 ℃,提取時間60 min,在此工藝條件下,白豆蔻總黃酮提取率為2.82%,說明該優(yōu)化工藝條件穩(wěn)定,可以作為白豆蔻總黃酮的提取工藝條件。白豆蔻對羥基自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除實(shí)驗(yàn)顯示,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對·OH的最大清除率為73.7%,對O2-·的最大清除率為90.1%,與Vc對照品比較可知,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)白豆蔻總黃酮對·OH的清除能力略低于Vc,對O2-·的清除能力與Vc相當(dāng),說明白豆蔻總黃酮對·OH和O2-·均具有一定的清除能力。本研究結(jié)果可為白豆蔻總黃酮類化合物的工業(yè)化生產(chǎn)和進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論參考。