宋統(tǒng)球,高艷榮,王素華,白宇超,賈玉巧

包頭醫(yī)學(xué)院毒理教研室(公共衛(wèi)生學(xué)院),內(nèi)蒙古 包頭 014060

塵肺病呈進(jìn)行性加重且不可逆轉(zhuǎn)，不僅造成職業(yè)病病人健康損害，又給國(guó)家?guī)?lái)巨大的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。長(zhǎng)期吸入稀土粉塵可引起肺的纖維性變，稱為稀土塵肺[1]。Th1/Th2 型細(xì)胞因子反應(yīng)失衡是肺纖維化的研究熱點(diǎn)之一[2]。研究中發(fā)現(xiàn)[3]：Th2 型細(xì)胞因子在肺纖維化中起主要作用，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化、增生，使膠原蛋白合成增加，并抑制其降解，最終導(dǎo)致基質(zhì)蛋白沉積和纖維組織生成；Th1 型細(xì)胞因子可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖和纖維組織的生成，并能抑制Th2 型細(xì)胞因子的釋放，減少纖維化。DNA 甲基化可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子基因活性，影響Th1、Th2 型細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Th1/Th2 細(xì)胞因子間失衡，IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化時(shí)會(huì)導(dǎo)致其分泌減少甚至不分泌[4]，IL-10啟動(dòng)子區(qū)存在CpG 位點(diǎn)，且啟動(dòng)子區(qū)甲基化與IL-10 的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)[5]，因此，本研究擬通過(guò)測(cè)定塵肺工人外周血釹含量和Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ及Th2 型細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)，并檢測(cè)它們啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，了解塵肺工人暴露水平及機(jī)體免疫狀況，從分子水平探討釹粉塵致塵肺機(jī)理。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

收集某稀土廠釹作業(yè)塵肺病患者22 例作為塵肺組，均符合《GBZ70-2015 塵肺診斷標(biāo)準(zhǔn)》中塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取年齡、工齡相匹配的無(wú)粉塵暴露的行政管理人員22 例作為對(duì)照組。所選研究對(duì)象均為男性，排除吸煙、肺結(jié)核、肺炎及其他纖維化及結(jié)締組織疾病，并進(jìn)行健康體檢。該研究經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)論證通過(guò)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 問(wèn)卷調(diào)查 采用統(tǒng)一設(shè)計(jì)的調(diào)查表，按照統(tǒng)一的方法及標(biāo)準(zhǔn)，由經(jīng)培訓(xùn)的調(diào)查員對(duì)調(diào)查對(duì)象進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括年齡、工齡、職業(yè)史、既往史、吸煙情況等。

1.2.2 血液樣品的采集 經(jīng)知情同意，采用專用的抗凝采血管采集清晨空腹全血樣5.0 mL，另采集5.0 mL 全血自然凝固后取血清。所有標(biāo)本皆-80 ℃冷凍保存。

1.2.3 全血釹濃度測(cè)定 全血采用混合酸溫控濕式消解法[6]預(yù)處理血樣，用釹標(biāo)準(zhǔn)液（1000 μg/mL，國(guó)家有色金屬及電子材料測(cè)試中心）配制標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線溶液，濃度為5、10，20，30，40，50，100μg/L。采用iCAP Q 等離子質(zhì)譜儀(Thermofisher，美國(guó))測(cè)定釹的含量，以響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得相應(yīng)的元素含量。

1.2.4 血清中IL-10 和IFN-γ含量檢測(cè) 將血清樣本至于溫室復(fù)融，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書（南京建成，中國(guó)）操作，加入顯色劑后用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（BIO-TEK，美國(guó)）測(cè)波長(zhǎng)450 nm 的光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中的含量。

1.2.5 IFN-γ和IL-10 啟動(dòng)子甲基化檢測(cè) 在NCBI 上截取基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游5000 bp 至下游1000 bp 序列，利用CpG 島在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站http：//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/預(yù)測(cè)序列潛在的CpG 島，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)潛在CpG 島。根據(jù)Mikeska 等[7]提出的引物設(shè)計(jì)的一般規(guī)則和建議，用sequenom?EpiDesigner 程序?qū)π蛄羞M(jìn)行引物方案設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)引物序列（由北京博淼生物公司合成）。使用血液基因組DNA 提取試劑盒（DP318，北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。NanoDrop 1000 分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，USA）檢測(cè)提取的DNA 純度、濃度。純度要求A260/A280在1.7～2.0 之間，DNA 濃度大于30 ng/μL；樣本體積大于50μL。并用1%瓊脂糖凝膠電泳，并觀察電泳條帶有無(wú)明顯降解。采用美國(guó)Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit試劑盒對(duì)DNA樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)化?；厥盏腄NA 按表1 所列引物和反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測(cè)，見(jiàn)圖1。

表1 IL-10、IFN-γ甲基化引物序列和反應(yīng)條件Table 1 IL-10、IFN-γ methylation primer sequences and reaction conditions

圖1 啟動(dòng)子甲基化電泳圖（部分）Fig.1 Promoter methylation electrophoresis(part)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布資料，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)描述以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布時(shí)以中位數(shù)和四分位間距M（Q）表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性采用多重線性回歸分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 研究對(duì)象一般情況

塵肺組與對(duì)照組兩組人員年齡、工齡經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。體檢異常項(xiàng)目經(jīng)x2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），因此兩組資料具有可比性（見(jiàn)表2）。

表2 塵肺組與對(duì)照組一般資料比較Table 2 Comparison of general data between pneumoconiosis group and control group

2.2 血液中釹及血清細(xì)胞因子含量比較

塵肺組全血釹含量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，塵肺組血清IL-10 含量及IL-10 與IFN-γ的比值高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，塵肺組血清IFN-γ含量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表3 血液中釹及血清細(xì)胞因子含量比較Table 3 Comparison of neodymium and serum cytokines in blood

2.3 IFN-γ和IL-10 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

根據(jù)MassARRY EpiTYPER 質(zhì)譜儀分析提供的圖譜數(shù)據(jù)，精確定位到基因片段每個(gè)CpG 單位的甲基化狀態(tài)，用甲基化率量化每個(gè)CpG 單位。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 位點(diǎn)總數(shù)7 個(gè)，全部檢出。IL-10 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 位點(diǎn)總數(shù)16 個(gè)，其中的CpG5 和CpG6 因?yàn)槊盖兄螽a(chǎn)生的片段分子量大小一樣，因而產(chǎn)物峰落在同一位置而被合并檢出，最終顯示的結(jié)果為上5、6 點(diǎn)的平均甲基化程度，CpG10 未檢出，CpG_11 超過(guò)30%未檢出，故剔除[8]。利用聚類分析法分析IFN-γ和IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 位點(diǎn)甲基化率在兩樣本中的分布趨勢(shì)，采用Cluster 3.0 軟件、TreeView 軟件進(jìn)行分層聚類分析，發(fā)現(xiàn)塵肺組IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)甲基化率要高于對(duì)照組，IL-10 啟動(dòng)子區(qū)甲基化率要低于對(duì)照組，（見(jiàn)圖2，3）。

圖2 塵肺組和對(duì)照組IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)各CpG 位點(diǎn)甲基化率聚類分析Fig.2 Cluster analysis of methylation rate of CpG loci in IFN—γ promoter region of pneumoconiosis group and control group

圖3 塵肺組和對(duì)照組IL-10 基因啟動(dòng)子區(qū)各CpG 位點(diǎn)甲基化率聚類分析Fig.3 Cluster analysis of methylation rate of CpG loci in IL-10 promoter region in pneumoconiosis group and control group

經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IFN-γ和IL-10 甲基化的數(shù)據(jù)非正態(tài)，采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)比較甲基化的差異。IFN-γ啟動(dòng)子7 個(gè)CpG 位點(diǎn)中：CpG1、CpG4、CpG7 的甲基化水平高于對(duì)照組（P<0.05），而其它的CpG 單位CpG2，CpG3，CpG5，CpG6 則沒(méi)有顯著差異性（P>0.05）。IL-10 啟動(dòng)子13 個(gè)CpG 位點(diǎn)中：CpG1、CpG5.6、CpG9、CpG15 的甲基化水平明顯低于正常對(duì)照組（P<0.05），而其它的CpG 單位CCpG2、CpG3、CpG4、CpG7、CpG8、CpG12、CpG13、CpG14 和CpG16 則沒(méi)有顯著差異性（P>0.05）（見(jiàn)表4、5）。

表4 IFN-γ基因甲基化檢測(cè)結(jié)果M（Q）Table 4 IFN-γ gene methylation test results M(Q)

表5 IL-10 基因甲基化檢測(cè)結(jié)果M（Q）Table 5 IL-10 gene methylation test results M(Q)

2.4 多重線性回歸分析

以IFN-γ和IL-10 基因啟動(dòng)子區(qū)有差異的CpG 位點(diǎn)作為因變量，以工齡、年齡、血液中釹含量、血清細(xì)胞因子含量及IL-10 與IFN-γ的比值作為自變量，多重線性回歸分析采用逐步法，結(jié)果顯示：IFN-γ的CpG1、CpG7 和IL-10/IFN-γ的比值存在線性相關(guān)，IL-10 中的CpG1、CpG5.6 和IL-10/IFN-γ的比值存在線性相，CpG15 和IL-10、IL-10/IFN-γ的比值存在線性相關(guān)（見(jiàn)表6、7、8）。

表6 IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)有差異的CpG 位點(diǎn)與各因素多重線性回歸分析結(jié)果Table 6 Multiple linear regression analysis of different CpG loci and factors in IFN-γ gene promoter region

表7 IL-10 基因啟動(dòng)子區(qū)有差異的CpG 位點(diǎn)與各因素多重線性回歸分析結(jié)果Table 7 Multiple linear regression analysis of different CpG loci and factors in IL-10 gene promoter region

表8 IL-10 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG15 位點(diǎn)與各因素多重線性回歸分析結(jié)果Table 8 Multiple linear regression analysis of CpG15 loci and factors in IL-10 gene promoter region

3 討論

氧化釹粒徑小于0.2μm，研究表明，粒徑小于25μm 的顆粒物，能夠進(jìn)入肺泡沉積在肺部，是導(dǎo)致塵肺病的主要元兇[9]。由于粉塵無(wú)法排出體外，肺組織會(huì)不斷吞噬和釋放粉塵，塵肺患者雖脫離粉塵環(huán)境，病變?nèi)詴?huì)不斷進(jìn)展，通過(guò)肺灌洗可以從塵肺患者肺中洗出大量粉塵[10]。本研究顯示，塵肺組工人血中釹水平明顯高于對(duì)照組，表明塵肺患者肺組織中存在大量氧化釹粉塵，是稀土釹作業(yè)工人患?jí)m肺病的主要致病因素。

研究表明，塵肺患者體內(nèi)存在Th1 和Th2 免疫失衡[11]，Annacker 等[12]證實(shí)Th2 型細(xì)胞因子IL-10可以抑制Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生，王海椒等[13]發(fā)現(xiàn)塵肺患者肺部存在明顯的Th2 免疫優(yōu)勢(shì)表達(dá)，同時(shí)患者血清中IL-10 的含量高于正常人群；楊霞[14]在對(duì)二氧化硅致大鼠肺纖維化中發(fā)現(xiàn)，隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)，IFN-γ處于平穩(wěn)降低狀態(tài)；暴磊等[15]研究顯示，在大鼠矽肺形成后期，IFN-γ表達(dá)減弱，IL-10 表達(dá)顯著增強(qiáng)。本研究顯示塵肺組IL-10 含量大于與對(duì)照組，IFN-γ含量低于對(duì)照組，IL-10/IFN-γ在塵肺組中占優(yōu)勢(shì)，這表明塵肺患者IL-10 優(yōu)勢(shì)表達(dá)，IFN-γ受抑制。已有研究證實(shí)：IL-10可下調(diào)IFN-γ產(chǎn)生，促進(jìn)肺部纖維化反應(yīng)，同時(shí)誘導(dǎo)Th0 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞分化[16]，INF-γ可以抑制Th2細(xì)胞因子的釋放，對(duì)肺纖維化具有抑制作用[17]。

DNA 甲基化可以在不改變序列的情況下改變DNA 分子的活性，它可以調(diào)節(jié)基因活性并影響許多關(guān)鍵過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)[18]：基因啟動(dòng)子可通過(guò)高甲基化進(jìn)行基因沉默，使其喪失轉(zhuǎn)錄活性，同樣可通過(guò)去甲基化促進(jìn)基因的表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)，塵肺患者IFN-γ基因啟動(dòng)子甲基化率高于正常人群，而IL-10 基因啟動(dòng)子甲基化率低于正常人群，表明，IFN-γ基因表達(dá)受抑制，IL-10 基因表達(dá)異常增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化時(shí)會(huì)導(dǎo)致其分泌減少甚至不分泌[19]，Gonsky 等[20]在對(duì)炎性腸炎的研究中發(fā)現(xiàn)，IFN-γ啟動(dòng)子DNA 每降低5%甲基化百分比，IFN-γ基因表達(dá)水平升高將近3 倍，宋陽(yáng)等[21]發(fā)現(xiàn)：大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-10 降低與其啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化密切相關(guān)，付麗紅[22]用5-氮雜胞苷處理單個(gè)核細(xì)胞，可以逆轉(zhuǎn)IL-10 啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)并使其表達(dá)升高。本研究血清中IFN-γ、IL-10 的水平與其基因啟動(dòng)區(qū)甲基化率具有一致性，與上述相符。

多重線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，IFN-γ的CpG1、CpG7 甲基化水平和IL-10/IFN-γ的比值呈正相關(guān)（P<0.05），IL-10 中的CpG1、CpG5.6 水平和IL-10/IFN-γ的比值呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），CpG15 和IL-10、IL-10/IFN-γ的比值呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），提示細(xì)胞因子失衡，對(duì)甲基化具有反向作用。這可能與CD4輔助T 細(xì)胞極化有關(guān)，高濃度的IL-10 誘導(dǎo)CD4 輔助T 細(xì)胞向Th2 方向極化，同時(shí)抑制其向Th1方向極化，向Th2 方向極化時(shí)IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化，并可遺傳給子代細(xì)胞[19]。

4 結(jié)論

綜上所述，IL-10 與IFN-γ失衡及其基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平在釹塵肺的病情進(jìn)展中有重要的作用。