降解霉變玉米中黃曲霉毒素B1 的復(fù)合益生菌研制

趙閃閃 周 璞 劉 碩 常 娟 王 平 尹清強(qiáng)* 劉超齊 朱 群

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450046；2.舞鋼市畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，河南舞鋼462599；3.葉縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南葉縣467200；4.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng)453000）

玉米是畜禽飼料中的主要原料之一，在畜禽飼料中所占比例非常高，通?？梢赃_(dá)到50%～70%[1]。玉米在生長(zhǎng)、收獲、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中很容易發(fā)生霉變。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）的統(tǒng)計(jì)，每年全世界范圍內(nèi)大約有25%的農(nóng)產(chǎn)品受到霉菌毒素的污染，造成數(shù)百億美元的經(jīng)濟(jì)損失。隨著我國(guó)災(zāi)害氣候的頻頻發(fā)生，部分真菌毒素呈現(xiàn)污染加重的趨勢(shì)[2]。玉米霉變后會(huì)被霉菌代謝產(chǎn)物——霉菌毒素污染。目前已知的霉菌毒素有300多種，其中對(duì)人和動(dòng)物危害相對(duì)嚴(yán)重的有黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)[3]。AFB1 毒性最強(qiáng)、分布最廣、危害最大、致癌力最強(qiáng)[4-5]。

AFB1對(duì)家禽免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群減少，降低小腸中細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)[6]。豬攝食AFB1污染飼料會(huì)出現(xiàn)采食量減少、體重降低、肝和免疫功能受損，以及血清生化指標(biāo)的改變[7]。研究表明，肝癌高發(fā)區(qū)的地理分布與該地區(qū)食物被AFB1 污染程度呈正相關(guān)[8]。霉菌毒素污染是一個(gè)全球性的問(wèn)題，不僅造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且還關(guān)系到動(dòng)物生產(chǎn)和食品安全，直接影響人類(lèi)和畜禽的健康。

研究發(fā)現(xiàn)，很多種微生物都能抑制黃曲霉的生長(zhǎng)和霉菌毒素的產(chǎn)生，如乳酸菌、芽孢桿菌、假單胞菌、短小桿菌、地衣芽孢桿菌等[9]。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)lavobacterium aurantiacum能顯著地降低液體培養(yǎng)基中黃曲霉毒素的含量[10]。朱新貴等[11]將枯草芽孢桿菌、乳酸菌和醋酸菌與黃曲霉毒素液體培養(yǎng)60 h后，3種微生物對(duì)AFB1 的降解率分別為89%、88%和81%。Swary 等[12]研究證實(shí)，酵母細(xì)胞壁對(duì)霉菌毒素有較高的吸附率。本研究旨在通過(guò)將有降解AFB1功能的有益微生物進(jìn)行高效組合，研究其對(duì)霉變玉米中AFB1的降解能力，為提高受霉菌毒素污染玉米的飼用價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

霉變玉米來(lái)自河南省某飼料廠，產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、丁酸梭菌均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 微生物培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g、酵母浸粉10 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 ml、K2HPO42 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g，水1 000 ml，pH值為6.2～6.6。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g，水1 000 ml，pH值為7.0～7.2。

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、酵母浸粉10 g、葡萄糖20 g，水1 000 ml，pH值為7.0～7.2。

丁酸梭菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉3 g、牛肉膏10 g、葡萄糖5 g、氯化鈉5 g、乙酸鈉3 g、可溶性淀粉1 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05 g，水1 000 ml，pH值為6.8。

上述培養(yǎng)基為固體時(shí)需再加入2%瓊脂，定容后在121 ℃、0.15 MPa條件下滅菌20 min，備用。

1.3 菌種的活化

將實(shí)驗(yàn)室保存的枯草芽孢桿菌接種到LB 液體培養(yǎng)基中，放在37 ℃、180 r/min 的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。產(chǎn)朊假絲酵母接種到Y(jié)PD 培養(yǎng)基中，放在30 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。干酪乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。丁酸梭菌接種到丁酸梭菌液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h。菌種用平板涂布法測(cè)定活菌數(shù)后統(tǒng)一調(diào)整活菌數(shù)至1×109CFU/ml，菌種保存于4 ℃冰箱中備用。

1.4 響應(yīng)面回歸試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用Design-Expert 8.0.5 軟件中的Central Composite Design進(jìn)行4因素3水平的設(shè)計(jì)，將產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、丁酸梭菌4個(gè)微生物菌種作為設(shè)計(jì)的4個(gè)因素，分別定義為X1、X2、X3、X44個(gè)變量。以4 個(gè)菌種分別加入霉變玉米后對(duì)應(yīng)活菌數(shù)為1×104、1×105、1×106CFU/g 3種水平作為設(shè)計(jì)的三個(gè)編碼水平，并延伸了臂長(zhǎng)（-r和+r）。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.5 復(fù)合微生物菌群對(duì)霉變玉米中AFB1 降解的操作流程

按表1組合共有27個(gè)處理組，每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵時(shí)稱取72 g粉碎的霉變玉米置于1 L的燒杯中，量取27 ml蒸餾水與1 ml復(fù)合菌液混合均勻，加入霉變玉米中攪拌均勻，分裝到自封袋中，封口機(jī)密封，在37 ℃條件下培養(yǎng)4 d。另設(shè)1個(gè)不接種菌的空白對(duì)照組（3個(gè)重復(fù)）。在第4 d，分別以重復(fù)單位稱取10 g玉米樣品，加入到盛有50 ml 70%甲醇的100 ml 三角瓶中，提取的AFB1用德國(guó)拜發(fā)試劑盒測(cè)定，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 復(fù)合微生物菌群的優(yōu)化

按Design-Expert 8.0.5軟件給出的試驗(yàn)方案進(jìn)行霉變玉米的生物降解，以復(fù)合微生物菌群對(duì)霉變玉米AFB1 的降解率作為設(shè)計(jì)的響應(yīng)值Y，進(jìn)行復(fù)合微生物菌群的優(yōu)化。對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合分析，得出回歸方程：Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β4X4+β12X1X2+β13X1X3+β14X1X4+β23X2X3+β24X2X4+β34X3X4+β11X12+β22X22+β33X32+β44X42+β123X1X2X3+β124X1X2X4+β134X1X3X4+β234X2X3X4+β122X12X2+β132X12X3+β142X1X4+β12#X1X22+β1234X1X2X3X4+β12*X12X22。

式中：Y——預(yù)測(cè)的毒素降解率（%）；

X1、X2、X3、X4——自變量，分別對(duì)應(yīng)產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、丁酸梭菌；

β0——截距；

β1、β2、β3、β4——線性系數(shù)；

β12、β13、β14、β23、β24、β34、β123、β124、β134、β234、β122、β132、β142、β12#、β1234、β12*——交叉系數(shù)；

β11、β22、β33、β44——平方系數(shù)。

對(duì)方程進(jìn)行方差分析及擬合度檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求后，點(diǎn)擊軟件Optimization 選項(xiàng)的Numerical優(yōu)化功能，把Y的響應(yīng)值選取最大值，利用軟件優(yōu)化得到4種菌的最優(yōu)組合模式。

1.7 最優(yōu)菌群組合方式優(yōu)化與驗(yàn)證

根據(jù)1.6節(jié)所得的回歸方程預(yù)測(cè)菌群最優(yōu)組合模式，按1.5 節(jié)霉變玉米中AFB1 降解流程進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。分別計(jì)算出最優(yōu)菌群組合模式對(duì)霉變玉米中AFB1 的降解率，與預(yù)測(cè)得到的降解率進(jìn)行比較，得出相對(duì)誤差。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003 軟件進(jìn)行初步處理，用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行ANOVA 方差統(tǒng)計(jì)分析。響應(yīng)面分析采用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行方差分析和作圖。試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生菌組合對(duì)霉變玉米中AFB1的降解作用

由表2 可知，不同的益生菌組合對(duì)霉變玉米中AFB1的降解率不同，最大AFB1降解率組為第12組，達(dá)到了50.24%（P＜0.05），即產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、丁酸梭菌的活菌數(shù)分別為1×106、1×106、1×104、1×106CFU/g。

2.2 響應(yīng)面模型構(gòu)建及方差分析

把不同微生物組合菌群組合模式對(duì)霉變玉米中AFB1 的降解率作為響應(yīng)值，將試驗(yàn)結(jié)果填入響應(yīng)值列后，利用Design-Expert 8.0.5 軟件對(duì)模型進(jìn)行多元四次回歸分析：可得出回歸方程：Y=38.82-0.14X1+4.62X2+0.86X3-0.86X4+2.84X1X2-1.17X1X3-0.20X1X4-0.74X2X3+3.83X2X4+0.58X3X4-0.24X12+0.54X22-2.46X32-2.05X42-6.02X1X2X3+4.66X1X2X4+0.58X1X3X4+1.15X2X3X4-1.38X12X2+3.45X12X3-2.44X12X4+1.01X1X22-4.93X1X2X3X4-2.54X12X22。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3，該回歸模型P＞0.05，決定系數(shù)R2=0.98，矯正后R2=0.86，表明該模型擬合度較好。

表2 不同益生菌組合對(duì)霉變玉米中AFB1的降解率（n=3）

表3 響應(yīng)值回歸方程的方差分析

2.3 最優(yōu)組合優(yōu)化與驗(yàn)證

利用Design-Expert 8.0.5 軟件分析，預(yù)測(cè)出霉變玉米中降解率最高的最優(yōu)益生菌組合水平與12組重疊，換算后接種到發(fā)霉玉米中的活菌數(shù)分別為1×106、1×106、1×104、1×106CFU/g。在此條件下，經(jīng)過(guò)第二次試驗(yàn)驗(yàn)證霉變玉米中AFB1 的降解率為59.18%，與第一次試驗(yàn)結(jié)果很接近，說(shuō)明通過(guò)該響應(yīng)面模型能較好地預(yù)測(cè)出復(fù)合益生菌對(duì)霉變玉米中AFB1 的降解率。

3 討論

霉菌毒素的脫毒方法包括物理、化學(xué)和生物法。物理和化學(xué)方法由于存在較多的弊端，很少在生產(chǎn)中應(yīng)用。生物脫毒法主要包括微生物降解和酶解兩種。微生物（乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等）對(duì)霉菌毒素的解毒機(jī)理包括發(fā)生在菌體內(nèi)的生化反應(yīng)、代謝物（包括酶等）的分解作用以及菌體對(duì)毒素的吸附作用等[13]。微生物降解霉菌毒素，具有不改變飼料原料本身的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官品質(zhì)，無(wú)有害殘留和成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到人們的廣泛關(guān)注[14]。Peltonen等[15]將乳酸菌和一定濃度AFB1 在37 ℃培養(yǎng)24 h 后測(cè)定AFB1 的含量，結(jié)果表明2 株Lactobacillus amylovorus和1 株Lactobacillus rhamnosus 可以降解50%以上的AFB1。Bluma 等[16]篩選出的多株芽孢桿菌，皆對(duì)黃曲霉以及寄生曲霉類(lèi)的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用。研究表明，與益生菌單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)霉菌生長(zhǎng)的抑制作用相比，益生菌組合對(duì)霉菌生長(zhǎng)和霉菌毒素的產(chǎn)生具有更好的抑制效果，這可能與菌株的協(xié)同作用和培養(yǎng)過(guò)程中所產(chǎn)生的復(fù)雜產(chǎn)物有關(guān)[17]。據(jù)報(bào)道，當(dāng)單一的枯草芽孢桿菌與霉變玉米液態(tài)共培養(yǎng)時(shí)，能較好地降解霉變玉米中的AFB1[18]。目前，關(guān)于復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵霉變玉米來(lái)降解AFB1 的報(bào)道不多，本研究獲得的益生菌組合，通過(guò)降解霉變玉米中的AFB1，可提高霉變玉米的飼用價(jià)值，對(duì)于飼料資源的開(kāi)發(fā)利用、畜禽健康養(yǎng)殖及畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)具有重要意義。

4 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面的回歸試驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得了可降解霉變玉米中AFB1的產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和丁酸梭菌等益生菌的最佳組合，對(duì)霉變玉米中AFB1 的降解達(dá)到59.18%，對(duì)提高霉變飼料的飼用價(jià)值意義重大。