2株固氮菌的分離與鑒定

陸依琳 趙晴雨 彭學(xué)

摘要：氮是植物生長(zhǎng)過(guò)程中不可或缺的元素，目前人們主要采用化學(xué)方法生產(chǎn)氮肥，但是這種方法存在很多缺陷。固氮菌（nitrogen-fixing bacteria）作為一種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌，由于其具有嚴(yán)格好氧的特點(diǎn)，每年都可以固定得到1億t以上的氮肥，在解決氮素來(lái)源問(wèn)題上顯示出了巨大的潛力。旨在以葡萄糖為唯一碳源，以江蘇師范大學(xué)的校園土壤為研究對(duì)象，在Ashby培養(yǎng)基上進(jìn)行固氮菌的分離。結(jié)果表明，從江蘇師范大學(xué)校園土壤中共分離得到2株固氮菌，分別命名為菌株610、611;根據(jù)革蘭氏染色和生理生化分析結(jié)果，菌株610、611均為革蘭氏陰性菌，菌株610生長(zhǎng)的最適溫度為 35 ℃，最適pH值為7，菌株611生長(zhǎng)的最適溫度為30 ℃，最適pH值為8。2株菌株的16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示，菌株610與Arthrobacter nitrophenolicus（硝基酚類節(jié)桿菌）的相似度為99.49%，菌株611與Pseudomonas fulva（黃褐假單胞菌）的相似度為98.95%。試驗(yàn)結(jié)果為今后高效生產(chǎn)固氮菌生物肥料提供了參考。

關(guān)鍵詞：固氮菌;分離;鑒定;硝基酚類節(jié)桿菌;黃褐假單胞菌

中圖分類號(hào)：S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）16-0298-04

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)氮素的需求量極大，因?yàn)榈墙M成氨基酸的基本元素，而氨基酸則是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位。氮?dú)猓∟2）體積約占空氣總體積的80%，且氮在空氣中主要以游離狀態(tài)存在，而生物體只能吸收利用化合態(tài)氮，因此需要依靠某些微生物體內(nèi)的固氮酶來(lái)固定空氣中游離的氮[1]。1972年，巴西的Dobereine在研究禾本科植物根際時(shí)發(fā)現(xiàn)了具有固氮作用的固氮菌，它能利用體內(nèi)的固氮酶把空氣中植物無(wú)法吸收的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氨態(tài)氮，并將其固定為植物可以直接利用的氮肥，該發(fā)現(xiàn)立即吸引了眾多科研工作者的目光，他們因此對(duì)固氮菌展開(kāi)了各方面的研究并獲得了令人滿意的成果[2]。

固氮菌主要有自生固氮菌、共生固氮菌和聯(lián)合固氮菌3種類型。目前，人們對(duì)固氮菌的研究主要集中在固氮菌形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生理生化特征等幾個(gè)方面，有些科學(xué)家則致力于研究適合固氮菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件、生長(zhǎng)方式等。固氮菌除了具有基本的固氮功能外，還能產(chǎn)生維生素、生長(zhǎng)素，進(jìn)而促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育，改善農(nóng)作物質(zhì)量[3]。Kumar等通過(guò)設(shè)計(jì)許多試驗(yàn)研究固氮菌對(duì)谷物的作用，結(jié)果表明，固氮菌在多數(shù)情況下都能提高谷物的產(chǎn)量[4]。固氮菌肥與化學(xué)肥料相比，具有安全環(huán)保的生態(tài)效益，施用固氮菌肥可以節(jié)約大量原料，并在一定程度上避免對(duì)環(huán)境造成污染[5]。不斷加強(qiáng)土壤固氮菌的篩選、改良、馴化等應(yīng)用研究，對(duì)于減少化學(xué)肥料的使用量、促進(jìn)農(nóng)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展、優(yōu)化土壤質(zhì)量等具有重大意義。目前，通過(guò)基因工程技術(shù)將固氮基因轉(zhuǎn)移至植物體內(nèi)從而使植物能夠發(fā)揮固氮作用已經(jīng)成為一項(xiàng)世界性的熱點(diǎn)課題。許多國(guó)家的科學(xué)家都熱衷于運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行固氮菌的固氮機(jī)制和轉(zhuǎn)移微生物固氮能力等方面的研究，并取得了不錯(cuò)的成果，展現(xiàn)出用固氮菌進(jìn)行生物固氮的良好前景[6]。

本試驗(yàn)以從江蘇師范大學(xué)校園環(huán)境中分離純化得到的固氮菌為研究對(duì)象，探究其生理生化特性，以期為后續(xù)生產(chǎn)高質(zhì)量的固氮菌肥提供基本的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料為江蘇師范大學(xué)校園內(nèi)土壤。

1.2 試劑

KH2PO4（上海生工，純度≥99.0%），MgSO4·7H2O（上海生工，純度≥99.0%），NaCl（上海生工，純度≥99.5%），CaSO4·2H2O（北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司，純度≥99.0%），CaCO3（上海生工，純度≥99.0%），葡萄糖（上海生工，純度≥99.5%），瓊脂（上海生工），LB肉湯（上海生工），草酸銨結(jié)晶紫（上海生工），番紅（上海生工），無(wú)水乙醇（上海生工，純度≥99.7%），碘液（上海生工），95%乙醇（用無(wú)水乙醇配制），細(xì)菌基因組抽提試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），瓊脂糖（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），50×TAE（自配），1×TAE（自配），DNA marker（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），DNA loading buffer（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），Gold View（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），16S rDNA擴(kuò)增試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）等。

1.3 菌株分離

以葡萄糖為唯一碳源，在Ashby培養(yǎng)基[7]上分離菌株。首先在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，然后經(jīng)平板涂布、三區(qū)劃線之后，獲得固氮菌的單菌落。將菌液與80%甘油水溶液按1 ∶ 1體積比混合后保存于 -80 ℃ 冰箱中。

1.4 菌種的鑒定

1.4.1 革蘭氏染色 對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色[8]，并在顯微鏡下觀察鑒定。若菌落呈紫色，則為革蘭氏陽(yáng)性菌;若呈紅色，則為革蘭氏陰性菌。

1.4.2 16S rDNA測(cè)定 用試劑盒提取固氮菌的全基因組DNA，并以此為模板進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增[9]。

PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1，混勻后放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循環(huán);72 ℃保溫10 min。PCR結(jié)束后，取2 μL反應(yīng)液與 2 μL DNA loading buffer混勻，并以3 μL DNA marker作為對(duì)照進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR擴(kuò)增是否成功。擴(kuò)增成功后將PCR反應(yīng)液純化，然后送到至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5 最適溫度的篩選

在3 mL LB液體試管中過(guò)夜培養(yǎng)固氮菌，轉(zhuǎn)移100 μL菌液于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，設(shè)3個(gè)錐形瓶為1組平行，將各組同時(shí)放入轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中，并設(shè)置不同的溫度梯度，5 h后測(cè)定D600 nm[10]。

1.6 最適pH值的篩選

在3 mL LB液體試管中過(guò)夜培養(yǎng)固氮菌，轉(zhuǎn)移100 μL菌液于100 mL具有不同pH值梯度的LB液體培養(yǎng)基中，以3個(gè)錐形瓶為1組平行，將各組同時(shí)放入轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中，5 h后測(cè)定D600 nm[11]。

1.7 生理生化反應(yīng)

在3 mL LB液體試管中過(guò)夜培養(yǎng)固氮菌。取1套生理生化管，用砂條割開(kāi)后，在每根生理生化管中均滴入3滴菌液，置于轉(zhuǎn)速為180 r/min的恒溫?fù)u床中，24 h后觀察各管反應(yīng)前后的顏色變化。

1.8 數(shù)據(jù)分析

在最適溫度和最適pH值的篩選試驗(yàn)中，先對(duì)每組3個(gè)平行樣取平均值，再根據(jù)平均值用Excel作出柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 2株菌株的形態(tài)特征

以江蘇師范大學(xué)的校園土壤為樣品，在以葡萄糖為唯一碳源的Ashby培養(yǎng)基上培養(yǎng)并篩選得到2株固氮菌，分別命名為菌株610、菌株611。其中菌株610的菌落形態(tài)為圓形、無(wú)色透明、邊緣整齊、表面光滑、濕潤(rùn)凸起，而菌株611的菌落形態(tài)為卵圓形、較小、呈乳白色、表面濕潤(rùn)、邊緣較整齊、中間隆起、含有菌絲。如圖1、圖2所示，經(jīng)革蘭氏染色并在油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌株610為短棒狀，菌株611為圓球狀，兩者都呈“8”字形，且呈現(xiàn)紅色，進(jìn)一步證明本研究分離的固氮菌屬于革蘭氏陰性菌，如圖1、圖2所示。

2.2 菌株610、611的16S rDNA電泳結(jié)果

以提取得到的菌株610、611的全基因組DNA為模板，以27F、1492R為引物，對(duì)2株固氮菌的16S rDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。由圖3可以看出，所得條帶大約在 1 500 bp 處，且單一明亮。

2.3 菌株610、611的測(cè)序結(jié)果及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

將菌株610、611的16S rDNA PCR反應(yīng)液純化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，獲得對(duì)應(yīng)序列，再將測(cè)序結(jié)果提交到模式菌株數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify）中，檢索與所測(cè)菌株序列相近的已知菌株，并用MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖4可以看出，菌株610與Arthrobacter nitrophenolicus（硝基酚類節(jié)桿菌）的相似性最高，相似度為99.49%;菌株611與Pseudomonas fulva（黃褐假單胞菌）最為相似，相似度為98.95%。

2.4 菌株610、611最適生長(zhǎng)溫度的篩選

溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響較大。由圖5所示，當(dāng)溫度為15～35 ℃時(shí)，隨著溫度的上升，菌株610的D600 nm也不斷升高，到35 ℃時(shí)達(dá)到最大值;當(dāng)溫度超過(guò)35 ℃后，隨著溫度的繼續(xù)升高，D600 nm反而開(kāi)始下降。因此可見(jiàn)，菌株610的最適生長(zhǎng)溫度是 35 ℃。菌株611在30 ℃時(shí)的D600 nm明顯高于其他組，因而菌株611的最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃。

2.5 菌株610、611生長(zhǎng)最適pH值的篩選

由圖6可以看出，菌株610可以在pH值為3～11的條件下生長(zhǎng)，且在pH值為7時(shí)生長(zhǎng)得最好，因此菌株610生長(zhǎng)的最適pH值為7; 而菌株611在pH值為8時(shí)的D600 nm明顯高于其他組，因此菌株611生長(zhǎng)的最適pH值為8。

2.6 菌株610、611的部分生理生化特征

用微量生化反應(yīng)管對(duì)固氮菌菌株610、611的部分生理生化特征進(jìn)行分析，將培養(yǎng)好的菌液注入用砂條割開(kāi)的生理生化管中培養(yǎng)24 h，觀察其顏色變化。由表2可以看出，菌株610僅能利用部分多糖物質(zhì)，如果糖、蔗糖、D-核糖等，同時(shí)能利用一些氨基酸和有機(jī)酸，如賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、精氨酸、丙二酸鹽等。而菌株611能利用大部分多糖物質(zhì)，如果糖、蔗糖、麥芽糖、棉籽糖、山梨糖、鼠李糖等，同時(shí)能利用賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、精氨酸等氨基酸;此外，菌株611可以利用部分有機(jī)酸，如尿素、丙二酸鹽等。

3 討論

關(guān)于從土壤中分離固氮菌的報(bào)道已經(jīng)有很多。本試驗(yàn)從江蘇師范大學(xué)校園土壤中成功分離出2株固氮菌，經(jīng)鑒定，這2株菌均為革蘭氏陰性菌，其中菌株610生長(zhǎng)的最適溫度為35 ℃，最適pH值為7;菌株611生長(zhǎng)的最適溫度為30 ℃，最適pH值為8。對(duì)2株菌株的16S rDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析可知，菌株610與Arthrobacter nitrophenolicus的相似度為99.49%，菌株611與Pseudomonas fulva的相似度為98.95%。固氮菌的研究發(fā)展對(duì)農(nóng)、林、牧、環(huán)境保護(hù)及能源利用等有著十分重大的理論和實(shí)際意義，然而目前科研人員進(jìn)行的生物固氮研究主要集中在共生固氮菌如根瘤菌上，關(guān)于其他類型固氮菌的基礎(chǔ)研究水平還需提高。

本試驗(yàn)對(duì)固氮菌進(jìn)行了分離與鑒定，僅完成了基礎(chǔ)的篩菌試驗(yàn)，若要進(jìn)一步研究固氮菌，還需對(duì)其固氨酶的活性進(jìn)行檢測(cè)，確定有無(wú)固氮活性及其活性大小[12]。隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因工程技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，科研人員正在研究用基因工程技術(shù)將固氮基因轉(zhuǎn)移從而使植物提高固氮效率，同時(shí)也在建構(gòu)新的固氮微生物，開(kāi)辟新的研究方向，發(fā)展前景非常廣闊[13]。

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