涂琦 ，楊軍平 ，楊小軍 ，周建 ，曹麗華

（江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，1.病理科；2.檢驗科，南昌 330006）

結(jié)直腸癌是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，發(fā)現(xiàn)時常常處于中晚期， 預后不佳。 目前的研究表明，包括GADD45a 在內(nèi)的多種通道的激活可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖，但機制不明。此前的研究中,發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT 信號通路參與調(diào)控GADD45a[1]。為明確結(jié)直腸癌中PI3K-AKT 信號通路中GADD45a作用機制，選擇PI3K-AKT-GADD45a 信號通路關(guān)鍵分子PI3K、p-p38， 使用免疫組織化學的方法檢測結(jié)直腸癌、 正常腸黏膜組織中GADD45a、PI3K和p-p38 的表達， 探討三者與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織標本 收集 2009 年 1 月-2014 年 12 月江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院病理科123 例結(jié)直腸癌標本， 另選取基本正常結(jié)直腸黏膜組織60 例作為對照。 根據(jù)WHO（2010）消化系統(tǒng)腫瘤分類標準進行分類， 由兩位資深病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法重新閱片診斷。 患者男 65 例，女 58 例；年齡 26-83 歲，平均59.65 歲；腫瘤直徑＜5cm 者 87 例，≥5cm 者 36 例；分化程度：高分化12 例，中分化93 例，低分化18例； 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者54 例， 無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者69 例。TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期 66 例， Ⅲ+Ⅳ期 57 例。 納入標準:⑴術(shù)前均未接受放、化療；⑵有完整的臨床和隨訪資料（隨訪截止日期2019 年12 月30 日）。

1.2 試劑 GADD45a 多克隆抗體（D122400，上海生工生物工程股份有限公司），PI3K(sc-1637，圣克魯斯生物技術(shù)有限公司）、p-p38(sc-7973，圣克魯斯生物技術(shù)有限公司），CFDA 免疫組化檢測試劑盒（GK6007）購自基因科技有限公司。

1.3 免疫組織化學 ⑴組織芯片制作：從123 例結(jié)直腸癌和60 例基本正常結(jié)直腸黏膜組織對照HE切片選取1mm 圓柱形組織， 將其放入空白蠟塊孔中，55°C 溫箱中烤 1h，完全融合后，室溫冷卻，備用切片。 ⑵采用EnliVision 法免疫組織化學染色：在123 例結(jié)直腸癌60 例正常結(jié)直腸黏膜組織中進行 GADD45a、PI3K、p-p38 免疫組織化學染色。使用防脫石蠟切片，切片經(jīng)60°C 恒溫烤箱中烤片2h；脫蠟、水化、消除內(nèi)源性過氧化物酶，使用高壓加熱抗原修復法， 加一抗 GADD45a（1：30）、PI3K(1：50)、p-p38 (1：50)4°C 孵育過夜；PBS 沖洗除去PBS， 每滴加聚合物增強劑孵育20min，PBS 沖洗；二抗室溫下孵育30min；DAB 溶液顯色自來水沖洗1min，蘇木素復染，分化、返藍；脫水、透明、中性樹膠封片；為防止出現(xiàn)假陽性和假陰性的可能，免疫組織化學實驗采用陽性對照和采用空白對照和組織內(nèi)對照作為陰性對照進行嚴格地質(zhì)量控制。

1.4 結(jié)果判斷 進行免疫組織化學染色判讀GADD45a 主要表達于細胞核，PI3K 陽性為細胞質(zhì)和/或細胞核;p-p38 表達于細胞核和/或細胞質(zhì)。 參照Takebayashi 標準， 每張切片先在低倍鏡（x100）下觀察，表達較強的區(qū)域，再切換至高倍鏡（x200）下觀察， 選取3 個高倍視野， 計算陽性細胞百分比，參考半定量積分法，對結(jié)果進行評判：⑴按照切片中陽性細胞百分比記分：陽性細胞數(shù)為陰性，記0 分；陽性細胞數(shù)為l%-10%，記1 分；陽性細胞數(shù)為11%-50%，記2 分；陽性細胞數(shù)為51%-75%，記 3 分,陽性細胞數(shù)為＞75%，記 4 分;⑵再根據(jù)細胞染色的強弱記分：與背景色一致，陽性細胞幾乎沒有染色計0 分； 陽性強度染色比背景色略高為淡黃色計1 分；明顯高于背景色為棕黃色計2 分；染色明顯為棕褐色計3 分。 然后按照陽性細胞百分比×染色強弱計積分，≥3 分為陽性表達，＜3 分為陰性表達。

1.5 統(tǒng)計學分析 用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，GADD45a、PI3K 和 p-p38 蛋白在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸黏膜中的表達與臨床病理學特征之間的關(guān)系分析采用χ2檢驗。 相關(guān)性檢驗采用Spearman 相關(guān)性分析。 單因素生存分析使用Kaplan-Meier 法，多因素生存分析采用Cox 風險回歸模型分析，組間比較采用log-rank 檢驗。 P＜0.05有統(tǒng)計學意義，P＜0.01 具有顯著的統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GADD45a、PI3K 和 p-p38 蛋白在結(jié)直腸癌、正常結(jié)直腸黏膜中的表達 結(jié)直腸癌組織中GADD45a 的表達水平低于正常結(jié)直腸黏膜組織，結(jié)直腸癌組織中PI3K 和p-p38 的表達水平高于正常結(jié)直腸黏膜組織，差異有顯著性(P＜0.01)。 （表1，圖1）

表1 GADD45a、PI3K 和p-p38 在結(jié)直腸癌與正常結(jié)直腸黏膜中的表達[n(%)]

圖1 結(jié)直腸癌與正常結(jié)直腸黏膜中GADD45a、PI3K 和p-p38的表達，EnliVision 法:A GADD45a 在正常腸黏膜組織中呈陽性表達（IHC×200）；B PI3K 在正常結(jié)直腸黏膜中呈陰性表達（IHC×200）；C p-p38 在正常結(jié)直腸黏膜中呈陰性表達（IHC×200）；D GADD45a 在結(jié)直腸癌組織中呈陰性表達（IHC×200）；E PI3K 在結(jié)直腸癌組織中呈陽性表達（IHC×400）；F p-p38 在結(jié)直腸癌組織中呈陽性表達（IHC×400）

2.2 GADD45a、PI3K 和 p-p38 蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理學特征相互關(guān)系 PI3K 的表達水平與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無、腫瘤TNM 分期有相關(guān)性 （P ＜0.05）， 與 其 他 臨 床 病 理 學 參 數(shù) 無 關(guān) 。GADD45a 和p-p38 的表達水平與臨床病理學參數(shù)無關(guān)（P＞0.05）。 （表2）

2.3 結(jié)直腸癌中 GADD45a 與PI3K、p-p38 蛋白的表達及其相關(guān)性 GADD45a 陽性表達組中，PI3K陰性表達比例高于PI3K 陽性表達，但統(tǒng)計學無差異(P＞0.05)。 Spearman 相關(guān)分析顯示，GADD45a 與p-p38 表達呈負相關(guān)(P＜0.05)（表3）。

2.4 生存分析 123 例結(jié)直腸癌患者中位生存時間為 60 個月， 平均 5 年生存率為 66.7%。 Kaplan-Meier 生存曲線顯示，GADD45a 蛋白陽性表達的結(jié)直腸癌患者總生存時間高于GADD45a 蛋白陰性表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖2A)。 PI3K、p-p38 蛋白陽性表達的結(jié)直腸癌患者總生存時間分別低于蛋白PI3K、p-p38 陰性表達者，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖2B、2C)。 Cox 回歸模型分析顯示GADD45a 陰性表達、TNM 分期、 腫瘤大小是結(jié)直腸癌預后的獨立危險因素（表4）。

表2 GADD45a、PI3K 和p-p38 蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理學特征相關(guān)性

表3 結(jié)直腸癌中GADD45a 與PI3K、p-p38 蛋白的表達及其相關(guān)性

3 討論

結(jié)直腸癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一，位列癌癥相關(guān)死亡原因第四位， 死亡率占全部惡性腫瘤死亡率的8%[2]。 對臨床而言，了解結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制有助于確定新的診斷和預后分子標志， 并能提供具有價值的臨床治療分子靶點，具有實現(xiàn)結(jié)直腸癌個體化診治的重要意義。

生長阻滯和DNA 損傷基因 (growth arrest and DNA damage)于1988 年克隆自經(jīng)紫外線照射后的中國倉鼠卵巢細胞[3]。GADD45a 基因位于1 號染色體 （1p31.2-p31.1） 編碼一個分子量約18.4kDa 大小,具有165 個氨基酸的DNA 損傷誘導蛋白,其作用與DNA 損傷修復、 細胞凋亡、 信號轉(zhuǎn)導有關(guān)。GADD45a 在多種腫瘤中出現(xiàn)表達改變, 乳腺癌表達較相應正常組織降低[4],非小細胞肺癌[5]表達未見明顯差異,而在胰腺導管腺癌[6]中表達卻增高。本實驗中結(jié)直腸癌組織中GADD45a 的表達水平低于正常結(jié)直腸黏膜組織差異且有顯著性統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。 不同的腫瘤中，GADD45a 表達水平表現(xiàn)不同，可能與腫瘤形成和發(fā)展機制及GADD45a 在不同信號通路相互作用和交叉對話中起作用不同或與實驗方法和樣本選擇不同有關(guān)。 在多種損傷因素如紫外線照射、電離輻射、烷化劑、營養(yǎng)缺失、化療藥物等作用下，GADD45a 可以依賴和非依賴p53 的方式表達上調(diào)。依賴P53 方式中，PI3K-AKT信號通路參與調(diào)控GADD45a，抑制AKT 的活性可誘導GADD45a 的基因表達[1]。 AKT 激活后可通過磷酸化作用激活或抑制下游的靶基因[7],包括：Casp ase9、NF-κB、mTOR、P21、FOXO3a 等。 FOXO3a 可激活下游組件GADD45a， 引起細胞G2/M 期生長阻滯[8]。在PI3K/Akt 信號通路選擇性抑制劑的干擾下，肝癌細胞中sCLU 和Gadd45a 的表達無明顯變化。 而Gadd45a 表達的調(diào)節(jié)可以影響Akt 的磷酸化水平[9]。 有研究發(fā)現(xiàn)，Myc 和 PI3K/AKT 協(xié)同抑制GADD45a 的表達[10]。 本實驗中，GADD45a 陽性表達組中，PI3K 陰性表達比例高于PI3K 陽性表達，但統(tǒng)計學無差異(P＞0.05)。 此結(jié)果與多信號通路協(xié)同作用有關(guān)，或是與樣本量有關(guān)需待進一步研究。

表4 結(jié)直腸癌患者預后多因素生存分析（n=123）

p38、ERK1/2、JNK 磷酸化已被證明能促進結(jié)直腸癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]，cyclinD1 也被證明與結(jié)直腸癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]。 本實驗中，p-p38 在結(jié)直腸癌中的表達明顯高于正常結(jié)直腸黏膜，證明p38 磷酸化與結(jié)直腸癌發(fā)生有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，GADD45a 基因敲除細胞可顯著降低細胞活力，加劇DNA 損傷，增加S 期阻滯，與p-p38、p-JNK 的顯著激活有關(guān)，而與 p-ERK 無關(guān)[13]。 其發(fā)生機制可 能與 GADD45α 對 通過上 調(diào)PP2Cα 的表達，對 MKK-JNK/p38 /AP-1 通路的抑制作用有關(guān)[14]。 本實驗通過Spearman 相關(guān)分析顯示 GADD45a 與 p-p38 表達呈負相關(guān) (P＜0.05)，可能與上述機制有關(guān)，需待相關(guān)實驗證實。 p-p38 在結(jié)直腸癌中表達升高， 且被認為是預后差的危險因素[15]。 本實驗中發(fā)現(xiàn)，p-p38 蛋白陽性表達的結(jié)直腸癌患者總生存時間低于p-p38 蛋白陰性表達者，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

在多種腫瘤中，GADD45a 與腫瘤預后相關(guān)，食管癌[16]、乳腺癌[4]GADD45a 陽性表達生存率高，GA DD45a 的高表達與AML 患者的DFS 中位數(shù)最低相關(guān)[17]。 本實驗中Kaplan-Meier 生存曲線顯示，GADD45a 蛋白陽性表達的結(jié)直腸癌患者總生存時間高于GADD45a 蛋白陰性表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Cox 回歸模型分析顯示 GADD45a 陰性表達、TNM 分期、腫瘤大小是結(jié)直腸癌預后的獨立危險因素。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中GADD45a 的陰性表達可能與p-p38 激活有關(guān)，GADD45a 陰性表達是結(jié)直腸癌預后的危險因素,可作為結(jié)直腸癌預后潛在分子標志物。 本實驗通過免疫組織化學的方法對 GADD45a、PI3K 和 p-p38 蛋白表達進行評估， 并對蛋白表達相關(guān)性及其臨床意義進行初步觀察和探討， 今后需增加樣本量并對其分子機制進行深入研究， 以揭示其分子機制。 深入研究GADD45a 在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制，對腫瘤監(jiān)測、診斷、藥物開發(fā)及預后等方面具有價值。