苗珍，李席席，高曉建，張雙明，姜姿妍，陳啟運，童帥旗，張曉君

(揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹(以下簡稱河蟹)，也稱大閘蟹，隸屬節(jié)肢動物門、甲殼綱、十足目，是一種在淡水中生長育肥、在海水中生殖繁衍的洄游性甲殼類動物。其營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，被譽為水產(chǎn)珍品，深受廣大消費者的青睞。隨著20世紀(jì)80年代河蟹人工育苗和養(yǎng)殖技術(shù)的突破，其養(yǎng)殖規(guī)模、養(yǎng)殖面積在逐漸擴(kuò)大，2016年我國成蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)81.21萬噸[1]。然而在河蟹大量養(yǎng)殖過程中也伴隨了一些病害的發(fā)生，尤其是由某些病原微生物特別是細(xì)菌引起的傳染病，常具有發(fā)病及死亡率高、在特定水環(huán)境中傳播速度快等特點，已成為制約其發(fā)展的不利因素之一。徐海圣等[2]從患病河蟹分離到致病菌副溶血弧菌(VibrioParahemolyticus)；姜光明等[3]從患病河蟹體內(nèi)分離到致病菌維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)和弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)；曹海鵬等[4]從患腸炎的河蟹體內(nèi)分離到點狀產(chǎn)氣單胞菌(Aeromonaspunctate)；徐海圣等[5]從患病河蟹體內(nèi)分離到易損氣單胞菌(Aeromonastrota)。2017至2018年課題組對江蘇省揚州多家河蟹養(yǎng)殖場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)病池塘河蟹大量死亡，不攝食、行動緩慢，活力下降，附肢無力，應(yīng)激能力減弱，個別出現(xiàn)在池塘周邊；病蟹體色較健康蟹灰暗，無光澤，病原檢測結(jié)果表明引起多家養(yǎng)殖場河蟹大批死亡的病原之一為弗氏檸檬酸桿菌。

弗氏檸檬酸桿菌隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)。該菌是一種“人-獸-魚”共染病原菌，可引起人、哺乳動物、魚、鱉、蝦等感染發(fā)病[6]。目前已有研究表明弗氏檸檬酸桿菌對紅螯螯蝦、中華絨螯蟹、三疣梭子蟹、中華鱉和克氏原螯蝦等多種水產(chǎn)動物具有致病性[7-10]。此外，F(xiàn)ernandez等[11]報道弗氏檸檬酸桿菌可導(dǎo)致新生劍吻鯨死亡。

本研究對分離自病蟹體內(nèi)的菌株LJ1進(jìn)行了形態(tài)特征、理化特性、16S rRNA和gyrB基因序列的同源性分析及致病性檢驗，確定該病原為致病性弗氏檸檬酸桿菌，該病原菌對河蟹的半數(shù)致死量(LD50)為2.1×106CFU/mL，且攜帶7種毒力基因，旨在為中華絨螯蟹病原學(xué)研究積累相關(guān)資料，為其相關(guān)疾病的防控提供一定的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌分離與純培養(yǎng)

從江都某養(yǎng)殖場，隨機取6只病蟹用生理鹽水多次洗滌后取肝胰腺以及肌肉劃線到LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。選取優(yōu)勢生長菌落進(jìn)一步劃線純化，將純化后的細(xì)菌接種到普通液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增，之后置于4 ℃冰箱中保存。

1.2 人工感染試驗

對分離菌株LJ1進(jìn)行人工感染試驗以確定其致病性。試驗用體長4 cm左右健康幼蟹，購自江蘇省金壇一河蟹養(yǎng)殖場。將菌株LJ1接種于普通LB液體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，4 000 r/min離心5 min后棄上清，沉淀用0.85% NaCl生理鹽水重懸，再次離心、重懸后，用生理鹽水將菌液制備成2.7×108、2.7×107、2.7×106、2.7×105、2.7×104CFU/mL共5個濃度梯度，分別用不同濃度的供試菌懸液對健康的幼蟹進(jìn)行肌肉注射感染，每個試驗組10只，每只注射0.1 mL；注射相同劑量的生理鹽水作對照。對感染后的幼蟹隔離培養(yǎng)，定時觀察并記錄河蟹的死亡情況，測定分離菌對河蟹的LD50[12]。

1.3 形態(tài)與理化特性檢驗

將上述純培養(yǎng)菌株分別接種于普通LB液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落的表型特征，同時對細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征，分離菌LJ1經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后在透射電子顯微鏡下觀察鞭毛等形態(tài)。依據(jù)文獻(xiàn)[13]進(jìn)行糖(醇和苷)類代謝、有機酸鹽利用、硝酸鹽還原等理化特性測定。

1.4 16S rRNA和gyrB基因序列測定與同源性分析

1.4.1 PCR模板DNA的制備

將菌株接種于普通液體培養(yǎng)基中，置于搖床中28 ℃培養(yǎng)18 h。取2 mL的菌液12 000 r/min離心1 min；棄上清液，將菌體懸浮于100 μL無菌生理鹽水中，100 ℃煮沸10 min；冰浴后12 000 r/min離心10 min；取上清液作為PCR模板。

1.4.2 16S rRNA和gyrB基因序列的PCR擴(kuò)增與測序

16S rRNA和gyrB基因序列的PCR擴(kuò)增方法參文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行，利用生工生物工程(上海)有限公司的DNA快速純化試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收純化，純化產(chǎn)物送上海生工測序。

1.4.3 16S rRNA和gyrB基因序列同源性分析

通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)對分離菌的16S rRNA基因和gyrB基因序列進(jìn)行序列同源性分析，并使用Clusta1X 2.0軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的序列相似性較高的菌株的序列進(jìn)行多序列比對，并對16S rRNA和gyrB基因采用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，采用鄰接建樹方法，并通過Bootstrap法(1 000次重復(fù))檢驗。

1.5 毒力基因檢測

為了進(jìn)一步分析菌株LJ1的致病性，篩選了定居因子(cfa)、尿素酶(ureG、ureF、ureE、ureD)、Vi抗原(viaB)、外膜蛋白(ompX)共7個毒力相關(guān)基因。采用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)弗氏檸檬酸桿菌全基因組序列(GenBank CP016762)設(shè)計特異性引物，引物見表1。

表1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物引物

PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×PowerTaqPCR MasterMix(南京諾唯贊生物科技有限公司提供)10 μL，正反引物各0.5 μL(10 μmol/L)，模板DNA 1 μL(29.81 ng/μL)，無菌雙蒸水8 μL；擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌致病性及LD50

供試菌株(LJ1)每組肌肉注射感染健康河蟹幼蟹10尾，供試幼蟹死亡情況見表2。感染后幼蟹表現(xiàn)出活力下降，行動遲緩，對外界刺激反應(yīng)慢等癥狀，分離菌LJ1對中華絨螯蟹的LD50為2.1× l06CFU/mL。從人工感染后的病蟹體內(nèi)再次分離到病原菌，經(jīng)鑒定與原感染菌株在菌落形態(tài)、生理生化特性等方面均一致，試驗結(jié)果表明分離菌LJ1為本次引起中華絨螯蟹大量死亡的病原菌，且具有較強的致病性。

表2 分離菌LJ1對中華絨螯蟹的致病性(n=10)

2.2 分離菌表型特征

菌株LJ1在LB培養(yǎng)基上菌落特征為表面濕潤光滑、中央隆起、邊緣整齊的淡黃色菌落，培養(yǎng)24 h觀察直徑多在2 mm左右。革蘭染色后觀察，菌體為革蘭陰性、短桿狀、兩端鈍圓、無芽胞及莢膜，多呈散在分布，大小為0.5～0.8 μm×0.5～1.0 μm。菌株LJ1經(jīng)透射電子顯微鏡觀察顯示，該細(xì)菌為周生鞭毛(圖1)。其他理化特性見表3。綜合分離菌株LJ1理化特性，與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)最接近。

圖1 分離菌LJ1電鏡下形態(tài)

表3 分離菌株的生理生化特性

2.3 16S rRNA和gyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

分離菌LJ1所擴(kuò)增的16S rRNA基因序列長度為1 408 bp(GenBank登錄號：MK421413)；所擴(kuò)增的gyrB基因序列長度為1 168 bp(GenBank登錄號：MK928323)。

將LJ1的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明與檸檬酸桿菌屬細(xì)菌的相似性在99%以上。16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析顯示，LJ1與弗氏檸檬酸桿菌(登錄號為KR698931、MF254749、MF716687)聚為一分支，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。gyrB基因同源性分析結(jié)果顯示，LJ1與弗氏檸檬酸桿菌的同源性最高，且與弗氏檸檬酸桿菌(GenBank登錄號為AY743920)的同源性在99%以上，結(jié)果如圖3所示。

?本試驗分離菌株

?本試驗分離菌株

2.4 弗氏檸檬酸桿菌毒力基因檢測

經(jīng)PCR檢測，菌株LJ1可以擴(kuò)增出cfa、ureG、ureF、ureE、ureD、viaB和ompX等7個毒力相關(guān)基因(圖4)。

M.DL2000 DNAmarker; 1.cfa(345 bp); 2.ureG(119 bp); 3.ureF(300 bp); 4.ureE(215 bp)、5.ureD(243 bp)；6.viaB(516 bp)；7.ompX(287 bp)

3 討論

弗氏檸檬酸桿菌為革蘭陰性菌，需氧或兼性厭氧，廣泛分布于自然界，土壤、水體、食物都有其分布，此外在哺乳動物、鳥類、爬行動物和兩棲動物等體內(nèi)也可分離。人類可因弗氏檸檬酸桿菌感染而發(fā)生腹瀉、食物中毒、腦膜炎、腦膿腫、敗血癥等。近年來，關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌導(dǎo)致水產(chǎn)動物患病的報道不斷增加，該菌可以導(dǎo)致羅非魚、中華鱉、克氏原螯蝦等患病，并造成大量死亡[15-16]。本研究對揚州市江都地區(qū)某養(yǎng)殖場患病的河蟹進(jìn)行病原學(xué)研究，從瀕死的河蟹肝胰腺、肌肉等病變組織分離大量優(yōu)勢生長細(xì)菌，并作純化培養(yǎng)，通過理化特性和分子鑒定表明分離菌為弗氏檸檬酸桿菌。人工回感試驗證實分離菌對健康梭子蟹具有較強的致病性, 而且從被感染死亡的河蟹體內(nèi)可回收到單一的原感染菌，由此證實引發(fā)此次河蟹暴發(fā)性疾病的病原是弗氏檸檬酸桿菌。

弗氏檸檬酸桿菌是一種存在水環(huán)境中的條件致病菌，但由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化，弗氏檸檬酸桿菌一旦侵入養(yǎng)殖動物體內(nèi)，便大量生長繁殖，產(chǎn)生毒力因子，導(dǎo)致疾病的暴發(fā)。弗氏檸檬酸桿菌的毒力因子主要包括黏附素、腸毒素、內(nèi)毒素等[17-18]。其中定居因子是弗氏檸檬酸桿菌重要的黏附素，已有研究表明，當(dāng)病原菌感染宿主時，主要靠細(xì)菌自身定居因子抗原黏附于腸道細(xì)胞，經(jīng)過定居、繁殖產(chǎn)生腸毒素而引發(fā)宿主死亡[19]。尿素酶也是弗氏檸檬酸桿菌另外一種重要的黏附素，通過尿素酶分解尿素，在菌體周圍形成氨云以抵御酸性外環(huán)境對菌體的損傷，使該菌順利在宿主體內(nèi)黏附定殖下來[20-21]。外膜蛋白OmpX是腸桿菌科細(xì)菌的一種重要毒力因子，OmpX屬于具有毒力特性的蛋白家族，有研究發(fā)現(xiàn)，OmpX參與細(xì)菌對細(xì)胞的黏附侵襲以及對抗宿主免疫防御的過程，在細(xì)菌的生長、運動、附著等方面有重要作用[22]。Vi抗原是細(xì)菌重要的毒力因子，有研究表明，該致病因子在宿主體內(nèi)存活以及逃避宿主體內(nèi)各種防御機制中起著廣泛作用[23]。因此，本研究對分離鑒定的弗氏檸檬酸桿菌在致病過程中起著重要作用的毒力因子包括cfa、ureG、ureF、ureE、ureD、viaB和ompX進(jìn)行檢測，結(jié)果表明LJ1菌株攜帶上述這7個毒力相關(guān)基因，說明強致病性可能與這些毒力相關(guān)基因有關(guān)。本試驗為后續(xù)開展河蟹相關(guān)疾病防控研究奠定了基礎(chǔ)。