張 潔，張大為*，田永航

（海南熱帶海洋學(xué)院 海南省海洋食品工程技術(shù)研究中心，海南 三亞 572022）

白貝（Monetaria moneta）別名貝子、貝齒、白海肥、白貝齒等，貝殼略呈扁圓形，表面光滑，氣微、味咸，含有鍶、磷、鈦等多種微量元素，其營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美。白貝價(jià)格低廉，同時(shí)是一種高營(yíng)養(yǎng)、低熱能的理想食物，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，主要分布于我國(guó)南海海域[1-2]。白貝作為鮮活食材，目前主要以簡(jiǎn)單烹調(diào)為主，市售白貝常出現(xiàn)死亡、腐敗等現(xiàn)象，不僅資源浪費(fèi)，而且容易出現(xiàn)食品安全事故。將白貝進(jìn)行深加工，不僅能解決上述問(wèn)題，而且還可以增加產(chǎn)品附加值，是促進(jìn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的有效途徑。

目前，我國(guó)調(diào)味品基本還處于以傳統(tǒng)谷氨酸鈉味精和復(fù)合化學(xué)調(diào)味料為主的階段，而如海產(chǎn)品發(fā)酵調(diào)味品這樣的復(fù)合天然調(diào)味料卻不多[3-5]。比如傳統(tǒng)的發(fā)酵魚(yú)露風(fēng)味優(yōu)良、營(yíng)養(yǎng)豐富，但它目前也還只在沿海地區(qū)被人們熟知，要走到更多家庭的餐桌上，還需要一段路程，改善其風(fēng)味，優(yōu)化其工藝，是像魚(yú)露這樣傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品必經(jīng)的歷程。所以，針對(duì)傳統(tǒng)調(diào)味品發(fā)酵周期長(zhǎng)等問(wèn)題，眾多研究者開(kāi)始關(guān)注速釀?wù){(diào)味品[6-8]。但國(guó)內(nèi)還沒(méi)有充分認(rèn)識(shí)到海產(chǎn)品天然調(diào)味品的價(jià)值，市場(chǎng)潛力未得到充分發(fā)掘。由于人們?nèi)狈?duì)天然調(diào)味品的認(rèn)識(shí)，嚴(yán)重制約了我國(guó)調(diào)味品行業(yè)的發(fā)展。我國(guó)調(diào)味品產(chǎn)品單一，基本處于初級(jí)加工階段，早已不符合人們及市場(chǎng)對(duì)產(chǎn)品深加工的要求[9]。如今的企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)激烈，只有不斷創(chuàng)新、優(yōu)化產(chǎn)品和工藝，才能給調(diào)味品行業(yè)帶來(lái)源源不斷的活力。極大的市場(chǎng)要求，無(wú)疑是發(fā)酵調(diào)味品攻占市場(chǎng)的重要機(jī)遇。發(fā)酵調(diào)味品是以動(dòng)、植物為原料，通過(guò)微生物發(fā)酵而得到的一類味道獨(dú)特的調(diào)味品，其香味成份非常復(fù)雜，其香味成分也根據(jù)原材料的不同而異[10-12]。

本試驗(yàn)以白貝為原料，采用自然發(fā)酵方式得到一種發(fā)酵調(diào)味液，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，為白貝產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和利用提供一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白貝、食用鹽：三亞市旺豪超市；pH緩沖劑、氫氧化鈉（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；結(jié)晶紫中性膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、緩沖葡萄糖煌綠膽鹽肉湯培養(yǎng)基：廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DPX-9082B-1型生化培養(yǎng)箱：金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；ME204E型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PB-10型pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SQ510C型高壓蒸汽滅菌鍋：重慶雅馬拓科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 白貝自然發(fā)酵調(diào)味液制備工藝流程及操作要點(diǎn)

白貝→原料處理→烘干、打漿→加入食鹽→發(fā)酵→過(guò)濾→滅菌→成品

操作要點(diǎn)：

白貝：選取新鮮白貝，加入0.9%的食鹽水浸泡2 h。

原料處理：將白貝去殼，取肉，去砂，洗凈。

烘干、打漿：將洗凈的白貝肉，均勻分開(kāi)攤平在鐵盤(pán)里，然后放入烘干箱，烘干溫度為35～55 ℃，烘干時(shí)間為20～60 min，且每隔10 min將白貝肉翻轉(zhuǎn)一次。將烘干到一定程度的白貝肉放入打漿機(jī)中打漿，備用。

加入食鹽：在白貝肉漿中加入10%～30%的食鹽，混勻，裝罐密封。

發(fā)酵：將添加食鹽的白貝漿在35～55 ℃的培養(yǎng)箱中發(fā)酵5～25 d。

過(guò)濾：將發(fā)酵好的白貝漿取出，用四層滅菌紗布過(guò)濾。

滅菌：將濾液在121 ℃、20 min條件下滅菌。

1.3.2 白貝自然發(fā)酵調(diào)味液制備工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，確定基礎(chǔ)發(fā)酵條件為：取一定量的白貝經(jīng)過(guò)預(yù)處理，烘干溫度為45 ℃，烘干時(shí)間為40 min，食鹽添加量為15%，發(fā)酵溫度為45 ℃，發(fā)酵時(shí)間為15 d。制得成品后，以氨基酸態(tài)氮含量結(jié)合感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)調(diào)味液進(jìn)行評(píng)價(jià)。考察不同烘干溫度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、烘干時(shí)間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）、食鹽添加量（10%、15%、20%、25%、30%）、發(fā)酵溫度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（5 d、10 d、15 d、20 d、25 d）對(duì)氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響。

1.3.3 白貝自然發(fā)酵調(diào)味液制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取食鹽添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）以及各自合適的水平，以氨基酸態(tài)氮含量（Y）為響應(yīng)值，+1，0，-1分別代表著高、中、低3個(gè)水平，進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization

1.3.4 感官評(píng)價(jià)

選取10名有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的食品專業(yè)人員進(jìn)行測(cè)評(píng)，取適量樣品，在自然光下觀察其色澤，狀態(tài)，并聞其氣味，按照國(guó)標(biāo)GB 2717—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 醬油》[13]感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)打分，最后取各項(xiàng)平均值之和作為總分，滿分100分，白貝自然發(fā)酵調(diào)味液感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 白貝自然發(fā)酵調(diào)味液感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of naturally fermented sauce from Monetaria moneta

1.3.5 測(cè)定方法

氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定參照GB 2009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中的酸度計(jì)法[14]；總酸的測(cè)定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中的酸堿滴定法[15]；總氮的測(cè)定參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法[16]；pH的測(cè)定參照GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測(cè)定》中均質(zhì)化試樣pH值的測(cè)定方法[17]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和作圖采用Origin 8.5，使用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 烘干溫度對(duì)調(diào)味液品質(zhì)的影響

圖1 烘干溫度對(duì)白貝自然發(fā)酵調(diào)味液品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of drying temperature on quality of natural fermentation sauce from Monetaria moneta

由圖1可知，調(diào)味液的氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分都隨著烘干溫度在35～55 ℃范圍內(nèi)的增加，呈先增加后減少的趨勢(shì)。烘干溫度為35 ℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分均為最低，此時(shí)發(fā)酵香氣一般，液體出現(xiàn)部分渾濁，但色澤均勻，烘干溫度太低，白貝含水量過(guò)高，導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中雜菌的過(guò)度繁殖，此時(shí)感官評(píng)分為64分，氨基酸態(tài)氮含量為0.54 g/100 g。隨著烘干溫度的逐漸升高，氨基酸態(tài)氮和感官評(píng)分均逐漸增加，烘干溫度為50 ℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分均達(dá)到最高，此時(shí)發(fā)酵液色澤均勻，質(zhì)地均一、無(wú)雜質(zhì)，發(fā)酵香氣較好，感官評(píng)分為75分，氨基酸態(tài)氮含量為0.68 g/100 g，之后氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分均下降。故最適烘干溫度為50 ℃。

2.1.2 烘干時(shí)間對(duì)調(diào)味液品質(zhì)的影響

圖2 烘干時(shí)間對(duì)白貝自然發(fā)酵調(diào)味液品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of drying time on the quality of naturally fermented sauce from Monetaria moneta

由圖2可知，隨著烘干時(shí)間在20～60 min范圍內(nèi)的增加，氨基酸態(tài)氮和感官評(píng)分呈先增加后降低的趨勢(shì)，烘干時(shí)間為30 min時(shí)，調(diào)味液品質(zhì)最好，此時(shí)氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分均達(dá)到最高，分別為0.65 g/100 g、78分，此時(shí)調(diào)味液色澤均一，發(fā)酵香氣較好。烘干時(shí)間的長(zhǎng)短決定調(diào)味液中水分含量，從而決定微生物和酶的活性。故白貝清洗后最適烘干時(shí)間為30 min。

2.1.3 食鹽添加量對(duì)調(diào)味液品質(zhì)的影響

圖3 食鹽添加量對(duì)白貝自然發(fā)酵調(diào)味液品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of salt addition on the quality of naturally fermented sauce from Monetaria moneta

由圖3可知，隨著食鹽添加量在10%～30%范圍內(nèi)的增加，發(fā)酵液的氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分先增加后減少。食鹽添加量為15%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量最高，為0.7 g/100 g，此時(shí)發(fā)酵香氣濃郁，發(fā)酵液有光澤，感官評(píng)分最高，為81分。食鹽添加量在10%時(shí)，由于過(guò)低的鹽分不足以抑制雜菌，使得白貝勻漿中的氨基酸態(tài)氮被消耗[18]，此時(shí)感官評(píng)分最低，為65分，氨基酸態(tài)氮含量為0.65 g/100 g，當(dāng)食鹽添加量＞15%時(shí)，感官評(píng)分和氨基酸態(tài)氮指標(biāo)逐漸下降。故最適食鹽添加量為15%。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)白貝自然發(fā)酵調(diào)味液品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of naturally fermented sauce from Monetaria moneta

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)調(diào)味液品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度在35～55 ℃范圍內(nèi)的增加，發(fā)酵液的氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分先增加后減少。發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮和感官評(píng)分都為最低值，此時(shí)，發(fā)酵液色澤暗淡，發(fā)酵香氣淡，液體出現(xiàn)渾濁，感官評(píng)分為45分。當(dāng)發(fā)酵溫度為50 ℃時(shí)，發(fā)酵液的氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分均達(dá)到最高值，此時(shí)，發(fā)酵液色澤均勻，有光澤，發(fā)酵香氣濃郁，且無(wú)雜質(zhì)，感官評(píng)分為達(dá)80分，氨基酸態(tài)氮為0.65 g/100 g。調(diào)味液的氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分在發(fā)酵溫度50 ℃后均下降。結(jié)果表明，提高發(fā)酵溫度可以促進(jìn)肉類組織的分解和溶出，有助于提高發(fā)酵液中的氨基酸態(tài)氮含量。但過(guò)高的發(fā)酵溫度，又會(huì)使蛋白質(zhì)活性降低，同時(shí)高溫讓發(fā)酵液中的鮮味與甜味氨基酸減少，苦味氨基酸含量增加，直接影響感官評(píng)分[20]。發(fā)酵溫度過(guò)低，氨基酸態(tài)氮含量低，表明白貝肉未完全分解，可能是因?yàn)榈蜏匾种屏说鞍酌傅幕钚远鴮?dǎo)致發(fā)酵不完全。故最適發(fā)酵溫度為50 ℃。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)調(diào)味液品質(zhì)的影響

由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在5～25 d范圍內(nèi)增加，發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加后趨于平穩(wěn)，感官評(píng)分先增加后減少。發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分均為最低，此時(shí)發(fā)酵液色澤暗淡，發(fā)酵香氣淡，出現(xiàn)渾濁，過(guò)短的發(fā)酵時(shí)間，白貝勻漿還未發(fā)酵完全，發(fā)酵時(shí)間為15 d時(shí)，發(fā)酵液發(fā)酵香氣濃郁，質(zhì)地均勻有光澤，感官最好，為82分，氨基酸態(tài)氮含量最高，為0.7 g/100 g，而15 d后，發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量基本保持不變。故最適發(fā)酵時(shí)間為15 d。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)白貝自然發(fā)酵調(diào)味液品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the quality of naturally fermented sauce from Monetaria moneta

2.2 制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定烘干溫度50 ℃，烘干時(shí)間為30 min，選取對(duì)結(jié)果影響較大的3個(gè)因素食鹽添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C），以氨基酸態(tài)氮含量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization

用Design-Expert 8.0.6對(duì)表3結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸方程如下：

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型的P＜0.000 1說(shuō)明該模型為極顯著，失擬項(xiàng)的P=0.144 4＞0.05，不顯著，表明試驗(yàn)結(jié)果誤差小。決定系數(shù)R2=0.991 3＞0.8，表明模型擬合效果好，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=1.91%＜10%，表明該試驗(yàn)的精確度和可信度都很高，綜上數(shù)據(jù)分析表明，該模型是可靠的。一次項(xiàng)A、交互項(xiàng)AB、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 響應(yīng)面分析

三維響應(yīng)面和等高線是回歸函數(shù)的圖形表示，反映了兩個(gè)變量之間的相互作用及響應(yīng)值與各變量試驗(yàn)水平之間的關(guān)系。越接近橢圓形的等高線，其交互作用越是顯著，而越接近圓形，說(shuō)明其交互作用越不明顯，等高線最小橢圓的中心點(diǎn)，是三維響應(yīng)曲面的最高點(diǎn)，就是所選范圍內(nèi)存在的極值。食鹽添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）對(duì)氨基酸態(tài)氮含量（Y）影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖6。

由圖6a可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間一定時(shí)，鹽分與發(fā)酵溫度的交互作用顯著，由響應(yīng)曲面圖看出，響應(yīng)曲面存在最高點(diǎn)，該范圍內(nèi)存在極值，該極大值出現(xiàn)在發(fā)酵溫度49 ℃左右，鹽分在14%左右。由圖6b可看出，當(dāng)發(fā)酵溫度一定時(shí)，鹽分與發(fā)酵時(shí)間的交互作用極顯著，響應(yīng)曲面存在最高點(diǎn)，則該范圍內(nèi)存在極值，最大值出現(xiàn)在鹽分為14%左右，發(fā)酵時(shí)間為15 d左右。由圖6c可知，當(dāng)鹽分一定時(shí)，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互作用顯著，從響應(yīng)曲面圖看出，圖形存在最高點(diǎn)，該范圍存在極值，最大值存在于發(fā)酵溫度為50 ℃左右，發(fā)酵時(shí)間在15 d左右。

圖6 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間及食鹽添加量交互作用對(duì)白貝自然發(fā)酵調(diào)味液氨基酸態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature,time and salt addition on amino acid nitrogen contents of naturally fermentation sauce from Monetaria moneta

由軟件分析直接得出最佳發(fā)酵條件為：食鹽的添加量為14.04%，發(fā)酵溫度為50.09 ℃，發(fā)酵時(shí)間為16.38 d，軟件預(yù)測(cè)氨基酸態(tài)氮含量為0.728 g/100 g。根據(jù)此分析結(jié)果，為了便于實(shí)際操作，將發(fā)酵條件修正為：食鹽的添加量為14%，發(fā)酵溫度為50 ℃，發(fā)酵時(shí)間為16 d進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到發(fā)酵調(diào)味液氨基酸態(tài)氮含量實(shí)際值為（0.723±0.01）g/100 g，與預(yù)測(cè)結(jié)果接近，證明試驗(yàn)分析可靠。

2.3 理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

經(jīng)過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化，最終成品發(fā)酵調(diào)味液的總酸含量為（35.28±0.03）g/L，氨基酸態(tài)氮含量為（0.723±0.01）g/100 g，pH值為5.43±0.02，總氮含量為（1.02±0.01）g/100 g。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)分析，得到了白貝發(fā)酵調(diào)味液的最佳制備工藝條件為：食鹽添加量14%，烘干溫度50 ℃，烘干時(shí)間30 min，發(fā)酵溫度為50 ℃，發(fā)酵時(shí)間為16 d。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液總酸含量為（35.28±0.03）g/L，氨基酸態(tài)氮含量為（0.723±0.01）g/100 g，總氮含量為（1.02±0.01）g/100 g，pH值為5.43±0.02。