周艷琳 谷李銘 李康生 王革非

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，新鄉(xiāng) 453003)

流感病毒主要通過呼吸道感染宿主呼吸系統(tǒng)，引起呼吸系統(tǒng)疾病[1，2]。在部分感染人群中會(huì)出現(xiàn)一定程度的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)組織病變和功能障礙，其中一個(gè)重要的并發(fā)癥是流感急性腦病(influenza acute encephalopathy，IAE)，流感病毒感染后，患者出現(xiàn)1～2 d的呼吸道癥狀，伴隨嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，并快速發(fā)展為認(rèn)知障礙、精神狀態(tài)改變，嚴(yán)重時(shí)引起神經(jīng)后遺癥甚至死亡[3-5]。

曠場(chǎng)試驗(yàn)也稱敞箱實(shí)驗(yàn)，是評(píng)價(jià)小鼠自發(fā)活動(dòng)行為和焦慮狀態(tài)的經(jīng)典行為學(xué)方法，被廣泛應(yīng)用于精神神經(jīng)藥理學(xué)、神經(jīng)行為學(xué)等的基礎(chǔ)研究，用于定量評(píng)價(jià)小鼠的自發(fā)活動(dòng)、探索行為及焦慮、抑郁狀態(tài)[6，7]。小鼠體質(zhì)量的變化可以反映流感病毒PR8滴鼻感染是否對(duì)小鼠食欲造成影響；運(yùn)動(dòng)總路程反應(yīng)小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)量的大小，運(yùn)動(dòng)量大表明其中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮，反之，則表明出現(xiàn)一定程度的抑郁狀況；周邊區(qū)域是小鼠的偏愛區(qū)域，周邊區(qū)域的活動(dòng)頻率可反映小鼠的趨避性。

有關(guān)呼吸道外周感染流感病毒對(duì)CNS調(diào)控的認(rèn)知、學(xué)習(xí)、空間記憶等行為的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究少有報(bào)道。因此，有必要建立流感病毒外周滴鼻感染的有效動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究流感病毒呼吸道感染對(duì)患鼠空間記憶、學(xué)習(xí)認(rèn)知、探索行為和抑郁情緒的影響。本研究以甲型流感病毒毒株H1N1 PR8分別感染C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠，采用曠場(chǎng)自發(fā)試驗(yàn)檢測(cè)C57BL/6J和BALB/c小鼠在感染急性期內(nèi)體質(zhì)量變化情況及在曠場(chǎng)行為箱內(nèi)的自發(fā)行為運(yùn)動(dòng)情況，研究哪種小鼠更適合做流感病毒感染的模型小鼠，為進(jìn)一步探究流感病毒感染對(duì)CNS損傷的機(jī)制及伴隨的學(xué)習(xí)、記憶、抑郁焦慮等行為學(xué)影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J雄性小鼠，12周齡，體質(zhì)量20～24 g，共20只；BALB/c雄性小鼠，12周齡，體質(zhì)量24～28 g，共20只。小鼠均購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，先飼養(yǎng)1～2周以適應(yīng)新環(huán)境。本研究遵循國(guó)家及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位制定的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的規(guī)則和制度。

1.1.2試劑與儀器 TRIzol、M-MLV kit、SYBR Green SuperMix購自Invitrogen公司；IL-1β、TNF-α、CXCL10、BDNF、GAPDH引物購自QIAGEN公司；ABI7500熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.1.3流感病毒毒株 H1N1病毒株A/Puerto Rico/8/34(簡(jiǎn)稱 PR8)，由廣東省汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室實(shí)驗(yàn)室保存，病毒滴度為1.2×107pfu/ml。病毒實(shí)驗(yàn)均在動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室(ABSL-3)中進(jìn)行。

1.1.4曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng) ZS-ZFT型曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)生物科技有限公司)由硬件和軟件兩部分構(gòu)成。硬件儀器主要由一個(gè)為20 cm×20 cm×30 cm的封閉箱子組成，箱子頂部中央安置攝像機(jī)，與記錄系統(tǒng)相連接，記錄小鼠在曠場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)情況，如總路程、中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)路程、周邊區(qū)域運(yùn)動(dòng)路程等[7]。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物處理 將C57BL/6J和BALB/c小鼠分別隨機(jī)分為2組，即C57BL/6J小鼠H1N1 PR8感染組(簡(jiǎn)稱PR8組)和C57BL/6J小鼠生理鹽水對(duì)照組(簡(jiǎn)稱CON組)，BALB/c小鼠H1N1 PR8感染組(簡(jiǎn)稱PR8組)和BALB/c小鼠生理鹽水對(duì)照組(簡(jiǎn)稱CON組)，每組10只，做好標(biāo)記。5%水合氯醛(0.004 ml/g)輕度麻醉后，滴鼻感染小鼠，50 μl/只，逐日觀察小鼠發(fā)病情況，記錄小鼠體質(zhì)量變化。

1.2.2曠場(chǎng)自發(fā)試驗(yàn) 每天上午9∶00～11∶00檢測(cè)小鼠在曠場(chǎng)行為箱行為運(yùn)動(dòng)情況，總時(shí)間5 min，連續(xù)檢測(cè)7 d。

1.2.3小鼠腦組織RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 在感染后的第7天處死小鼠，取腦組織，TRIzol法提取腦組織RNA，M-MLV kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qPCR檢測(cè)。

1.2.4小鼠腦組織炎癥因子的qPCR檢測(cè) 使用SYBR Green qPCR SuperMix試劑盒，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)腦組織中的炎癥因子TNF-α、IL-1β、CXCL10(C-X-C motif Ligand 10)、BDNF(brain derived neurotrophic factor)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)。qPCR反應(yīng)體系為20 μl，操作步驟按照Invitrogen公司說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1小鼠體質(zhì)量變化 圖1A為流感病毒PR8(1∶500)感染C57BL/6J小鼠后7 d內(nèi)的體質(zhì)量變化。結(jié)果顯示：C57BL/6J小鼠感染PR8后，小鼠體質(zhì)量逐漸下降，在感染后的第3、4、5、6、7天，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，在第7天處死的當(dāng)天，10只小鼠僅6只存活，生存率為60%；圖1B為流感病毒PR8(1∶100 000)感染BALB/c小鼠后7 d內(nèi)的體質(zhì)量變化。結(jié)果顯示：BALB/c小鼠感染PR8后，小鼠體質(zhì)量逐漸下降；在感染后的第6、7天，與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；10只小鼠全部存活，生存率為100%。前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，甲型流感病毒PR8 以1∶500稀釋度感染BALB/c小鼠，可引起小鼠全部死亡。后逐漸擴(kuò)大稀釋倍數(shù)，最終甲型流感病毒PR8采用1∶100 000稀釋倍數(shù)感染BALB/c小鼠，小鼠可全部存活，便于后期實(shí)驗(yàn)開展。提示流感病毒PR8感染后，兩種小鼠體質(zhì)量均下降，但BALB/c小鼠比C57BL/6J小鼠對(duì)流感病毒PR8更敏感。

圖1 滴鼻感染PR8對(duì)兩種品系小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect on weight of two strains mice infected intranasally with PR8

2.2運(yùn)動(dòng)總路程 圖2A是C57BL/6J小鼠在曠場(chǎng)行為箱體中運(yùn)動(dòng)總路程，結(jié)果顯示：CON組C57BL/6J小鼠運(yùn)動(dòng)量逐日減少，從第4天開始增加，符合小鼠自發(fā)活動(dòng)的總路程先強(qiáng)后弱后又恢復(fù)的時(shí)相特點(diǎn)，與嚙齒類動(dòng)物在新環(huán)境中先探索后熟悉環(huán)境的特點(diǎn)相符，表明小鼠曠場(chǎng)行為學(xué)研究造模成功；PR8感染組C57BL/6J小鼠行走總路程逐日減少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖2B是BALB/c小鼠在曠場(chǎng)行為箱體中運(yùn)動(dòng)總路程，結(jié)果顯示：PR8感染組BALB/c小鼠行走總路程逐日減少，并無恢復(fù)趨勢(shì)，且在感染后的第6天，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在感染后的第7天具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。提示PR8感染BALB/c與C57BL/6J均可引起小鼠自主活動(dòng)能力減弱，但BALB/c小鼠在感染后的第6、7天更加明顯，證實(shí)流感病毒PR8對(duì)于BALB/c小鼠自主活動(dòng)能力的影響更加顯著。

圖2 滴鼻感染病毒PR8后兩種品系小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的總運(yùn)動(dòng)路程Fig.2 Total distance movement of two strains mice infected intranasally with PR8 in open field test

2.3周邊區(qū)域運(yùn)動(dòng)路程 圖3是BALB/c小鼠在曠場(chǎng)自發(fā)試驗(yàn)中周邊區(qū)域行走路程，結(jié)果顯示，在感染后的第7天，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，雖然前6 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但PR8 treatment 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.001)。提示流感病毒PR8感染BALB/c小鼠引起小鼠趨避性增強(qiáng)，抑郁性增強(qiáng)，且在感染的急性期即第7天最為顯著。

圖3 BALB/c小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的總周邊運(yùn)動(dòng)路程Fig.3 Distance movement of BALB/c mice in out ring in open field test

2.4平均運(yùn)動(dòng)速度 圖4是BALB/c小鼠在曠場(chǎng)自發(fā)試驗(yàn)中一周內(nèi)平均運(yùn)動(dòng)速度情況。與對(duì)照組相比，在感染的第6、第7天差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明流感病毒PR8感染BALB/c小鼠引起活動(dòng)性減弱可能伴有小鼠肌肉酸痛無力等運(yùn)動(dòng)生理改變而影響運(yùn)動(dòng)情況。

圖4 滴鼻感染病毒PR8后BALB/c小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中平均運(yùn)動(dòng)速度Fig.4 Average movement speed of BALB/c mice in open field test infected intranasally PR8

2.5滴鼻感染流感病毒刺激BALB/c小鼠CNS炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平變化情況 滴鼻感染流感病毒PR8可引起B(yǎng)ALB/c小鼠在感染后第7天伴隨腦組織促炎因子、趨化因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(圖5)。其中促炎因子TNF-α轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)程度最高(P<0.01)，IL-1β變化與對(duì)照組相比差異性不顯著；趨化因子中CXCL 10的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P<0.05)；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P<0.05)。表明滴鼻感染流感病毒PR8引起B(yǎng)ALB/c小鼠CNS發(fā)生以促炎因子、趨化因子及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子過度釋放為主要特征的細(xì)胞因子風(fēng)暴，引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，引起自發(fā)行為的降低，并伴隨焦慮、抑郁等情緒障礙。

圖5 BALB/c小鼠在CNS中炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.5 Transcript levels of inflammatory factors of BALB/c mice in CNS

3 討論

臨床中，流感病毒感染除引發(fā)呼吸道癥狀外，亦會(huì)對(duì)CNS造成多種類型的流感相關(guān)腦癥綜合征，主要表現(xiàn)為情緒障礙、學(xué)習(xí)認(rèn)知下降、行為改變及自身免疫腦病等[3-5]。Jurgens等[8]發(fā)現(xiàn)流感病毒H1N1 PR8感染C57BL/6J小鼠在急性期可誘發(fā)神經(jīng)炎癥、改變海馬神經(jīng)元形態(tài)、損傷學(xué)習(xí)認(rèn)知能力。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒H1N1 WSN33外周滴鼻感染BALB/c小鼠，可引起小鼠在感染的急性期和恢復(fù)期自發(fā)行為改變，并伴隨抑郁、焦慮、緊張等情緒[7]。本研究對(duì)比非嗜神經(jīng)性流感病毒H1N1 PR8滴鼻感染兩種近交系小鼠C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠對(duì)曠場(chǎng)自發(fā)行為的敏感性，結(jié)果表明滴鼻感染流感病毒PR8可引起小鼠在急性期體質(zhì)量下降，肌肉酸痛活動(dòng)性降低，伴隨明顯的抑郁焦慮情緒；BALB/c小鼠對(duì)流感病毒PR8的敏感度較C57BL/6J小鼠明顯，更適宜做流感病毒PR8感染的模型小鼠。此實(shí)驗(yàn)中小鼠的周齡和性別需要保持一致，雌性小鼠有動(dòng)情周期，激素水平可能會(huì)影響行為，因此本實(shí)驗(yàn)全部采用雄性小鼠[9]。前期進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)分別以1∶500、1∶5 000、1∶50 000稀釋流感病毒PR8原液，外周滴鼻感染BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)其生存率分別為0、10%、50%，而甲型流感病毒PR8以1：500稀釋度感染C57BL/6J小鼠，小鼠的生存率為60%，BALB/c小鼠比C57BL/6J小鼠對(duì)流感病毒PR8更敏感。

小鼠自主活動(dòng)行為的改變與小鼠CNS損傷相關(guān)，有研究表明，幼年時(shí)期抑郁焦慮情緒會(huì)誘發(fā)成年后空間記憶、學(xué)習(xí)認(rèn)知等行為障礙[10]。本研究為進(jìn)一步研究流感病毒PR8感染對(duì)小鼠空間記憶、學(xué)習(xí)認(rèn)知、情緒等提供模型BALB/c小鼠，具有重要科學(xué)意義。目前較多學(xué)者認(rèn)為流感病毒外周感染引起小鼠CNS損傷，可能與體內(nèi)免疫分子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的“因子風(fēng)暴”有關(guān)，或與呼吸道或腸道微生物菌群環(huán)境變化打破菌群平衡有關(guān)[11-13]。本研究中患鼠不但伴有自發(fā)行為降低，抑郁、焦慮等情緒障礙，且CNS中促炎因子、趨化因子及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)不同程度的變化，表明流感病毒外周感染誘發(fā)的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂有關(guān)，但流感相關(guān)腦病的具體病理機(jī)制有待進(jìn)一步的探究。這是否與流感病毒感染后呼吸道或腸道微生物菌群平衡打破存在相關(guān)性還有待明確，為進(jìn)一步研究流感相關(guān)腦病的病理機(jī)制提供依據(jù)。