高虎濤，申曉林，孫新曉，王佳，袁其朋

（北京化工大學(xué)化工資源有效利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100029）

引 言

氨基酸是一種同時(shí)含有氨基和羧基基團(tuán)的有機(jī)小分子，多個(gè)氨基酸殘基按照一定的順序和排列方式，通過(guò)肽鍵連接組成了行使生命活動(dòng)的蛋白質(zhì)大分子。氨基酸不僅在生命體新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮十分重要的作用，隨著對(duì)氨基酸研究的不斷深入，其更多的功能被挖掘出來(lái)。例如基本氨基酸L?天門(mén)冬氨酸是天冬氨酸酐、四氫呋喃胺等多種化學(xué)品的前體物質(zhì)[1?2]，一些非蛋白質(zhì)氨基酸如L?茶氨酸具有保護(hù)神經(jīng)、抗疲勞和降血壓等方面的功效[3]，還有一些氨基酸的衍生物如5?羥基色氨酸是一種神經(jīng)遞質(zhì)5?羥色胺的直接前體，能夠治療抑郁、失眠等神經(jīng)類疾病[4]。隨著氨基酸潛在應(yīng)用價(jià)值的不斷發(fā)掘，工業(yè)化的腳步也隨之邁進(jìn)，1980 年后的20 年間，氨基酸市場(chǎng)主要以飼料添加氨基酸（L?賴氨酸、DL?蛋氨酸、L?蘇氨酸等）和食品添加氨基酸（L?谷氨酸、L?苯丙氨酸、L?天冬氨酸）為主[5]，但21 世紀(jì)后人們更青睞于具有特殊價(jià)值的氨基酸的專一化生產(chǎn)。全球氨基酸市場(chǎng)分析報(bào)告指出：預(yù)計(jì)到2022 年全球氨基酸市場(chǎng)將達(dá)到256 億 美 元 的 份 額[6]。

1907 年，東京帝國(guó)大學(xué)Ikeda 從紫菜中發(fā)現(xiàn)并提純具有增鮮作用的味精谷氨酸鈉，味之素公司開(kāi)始從經(jīng)過(guò)酸水解的小麥面筋和經(jīng)過(guò)脫脂處理過(guò)的大豆中提純谷氨酸鈉作為增鮮品出售[7]，氨基酸的工業(yè)化生產(chǎn)由此正式打開(kāi)了大門(mén)。但此時(shí)的生產(chǎn)方式僅僅是通過(guò)提取法或者化學(xué)合成的方法獲得。提取法原料需求量大，提取過(guò)程繁雜；化工合成成本高，反應(yīng)條件較為苛刻，有較大的安全隱患[8]，而且只能合成外消旋產(chǎn)物。這些問(wèn)題促使人們尋求更加簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、可持續(xù)的生產(chǎn)模式生產(chǎn)氨基酸。隨著合成生物學(xué)、基因工程、發(fā)酵工程等新興學(xué)科的深入研究，到20 世紀(jì)50 年代末，發(fā)酵技術(shù)被應(yīng)用于生產(chǎn)一部分氨基酸，奠定了現(xiàn)代發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的基礎(chǔ)[9]。

傳統(tǒng)發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸最大的問(wèn)題是盲目性，源于對(duì)更高產(chǎn)量的追求，人們不斷篩選較高產(chǎn)量的菌株，也就是通過(guò)誘變和篩選的方法來(lái)改良菌株，但是，隨機(jī)的突變通常導(dǎo)致基因組產(chǎn)生不確定的改變，因此不易判斷其產(chǎn)生的影響[10]。為了使構(gòu)建的微生物細(xì)胞工廠更具工業(yè)化競(jìng)爭(zhēng)力，菌株開(kāi)發(fā)已經(jīng)轉(zhuǎn)向有針對(duì)性的工程策略，建立了集系統(tǒng)生物學(xué)的計(jì)算技術(shù)、合成生物學(xué)的精細(xì)化設(shè)計(jì)理論、進(jìn)化工程合理和隨機(jī)的誘變方法、發(fā)酵工程的最優(yōu)化培養(yǎng)方案于一體的系統(tǒng)代謝工程[11?13]，在確定目標(biāo)產(chǎn)物及其代謝途徑后，通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)、削弱競(jìng)爭(zhēng)途徑、調(diào)節(jié)碳流量分配、提高對(duì)某中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物的耐受等方式，不斷改善菌株的生產(chǎn)性能，以構(gòu)建適合工業(yè)化生產(chǎn)的工程菌株。

本文將綜述不同的代謝調(diào)控策略在氨基酸及其衍生物的微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)中起到的獨(dú)特作用，分析不同代謝調(diào)控策略的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)，最后提出對(duì)利用微生物作為平臺(tái)生產(chǎn)氨基酸及其衍生物的前景與面臨的挑戰(zhàn)。

1 代謝工程調(diào)控策略

1.1 碳源的高效利用

利用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，最重要的是提高碳源的有效利用率。目前，研究者們常利用非磷酸烯醇丙酮酸：糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（non?phosphotransferase system，非PTS）代替野生菌天然的PTS 系統(tǒng)提高碳源的有效利用率[14?16]。天然的PTS 系統(tǒng)攝取葡萄糖的能力很高，但該系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖使用磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）作為磷酰基供體并將其轉(zhuǎn)化為丙酮酸，導(dǎo)致產(chǎn)物丙酮酸來(lái)不及消耗而積累[17]，而當(dāng)PTS 途徑中葡萄糖特異性EII 通透酶（PtsG）缺失后，細(xì)胞通過(guò)半乳糖滲透酶GalP 和甲基半乳糖苷滲透酶MglBAC 的非磷酸化方式攝取葡萄糖，隨后在葡萄糖激酶（glk 和ppgK）的催化下以三磷酸腺苷（ATP）或多聚磷酸鹽（PolyP，一種線性聚合物，存在于所有活細(xì)胞中）而不是PEP 作為磷?；w利用葡萄糖[18?19]，利用該非PTS系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的效率雖然有些降低但卻減少了副產(chǎn)物丙酮酸的溢流，使葡萄糖的有效利用率顯著提高。左旋鳥(niǎo)氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，研究發(fā)現(xiàn)它能夠加速傷口愈合并能有效維持心臟健康。Zhang 等[20]通過(guò)敲除肌醇滲透酶（IolT1 和IolT2，分別由iolT1 和iolT2 編碼）的一種阻遏蛋白基因iolR[21]和過(guò)表達(dá)iolT1 激活非PTS 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，與利用PTS 系統(tǒng)的對(duì)照菌株相比，在生長(zhǎng)速率大致相同的情況下，利用非PTS系統(tǒng)的菌株發(fā)酵上清液中檢測(cè)到濃度更低的葡萄糖，左旋鳥(niǎo)氨酸的產(chǎn)量增加了10%，這說(shuō)明非PTS途徑中葡萄糖的利用率有所提高，最終，在60 h的發(fā)酵中得到了43.6 μg/L的左旋鳥(niǎo)氨酸。Vogt等[22]在生產(chǎn)L?亮氨酸的研究中，同樣敲除了iolR 并利用非PTS系統(tǒng)，使葡萄糖的利用率提高了40%，L?亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到23.7 g/L。更進(jìn)一步的研究中，Xu 等[17]過(guò)表達(dá)了iolT1、iolT2 和ppgK，最終在補(bǔ)料分批發(fā)酵中利用該工程菌生產(chǎn)L?賴氨酸的最高產(chǎn)量為201.6 g/L[圖1(a)]。由于在芳香族氨基酸生產(chǎn)的代謝通路中，PTS 系統(tǒng)與莽草酸途徑競(jìng)爭(zhēng)重要中間代謝物PEP[23?24]，因此在大腸桿菌（Escherichia coli）中抑制PTS 系統(tǒng)，使更多的PEP 被用于生產(chǎn)芳香族化合物已經(jīng)成為一種成熟的代謝工程策略[25]。L?3,4?二羥基苯丙氨酸（L?DOPA）是用于治療帕金森氏疾病類藥物的主要前體物質(zhì)，Mu?oz 等[26]用galP（編碼半乳糖滲透酶）和glk（編碼葡萄糖激酶）替代PTS 功能，使L?DOPA 的前體L?酪氨酸的生產(chǎn)速率較利用PTS 途徑生產(chǎn)提高了3.7 倍，最終L?DOPA 的分批發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)量達(dá)到1.51 g/L[圖1(b)]。

圖1 碳源高效利用策略的應(yīng)用(a)L?賴氨酸在谷氨酸棒狀桿菌中的部分生物合成途徑;(b)L?3,4?二羥基苯丙氨酸在大腸桿菌中的生物合成途徑;(c)S?腺苷甲硫氨酸在解淀粉芽孢桿菌中的生物合成途徑;(d)4?羥基異亮氨酸在大腸桿菌中的生物合成途徑IolT1,IolT2—肌醇通透酶;EIIbglF—β?葡萄糖苷?PTS滲透酶;GlK,PpgK,Cgl2647—葡萄糖激酶;IICBGlc—整合膜葡萄糖通透酶;galP—半乳糖滲透酶基因;glk—葡萄糖激酶基因;sucC—琥珀酰?CoA合成酶基因;metA—高絲氨酸O?琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因;metB—胱硫醚?γ?半胱氨酸酶基因;IDH—異檸檬酸脫氫酶;IDO—L?異亮氨酸雙加氧酶;AceA—異檸檬酸連接酶;AceK—異檸檬酸脫氫酶激酶;SucAB—α?酮戊二酸脫氫酶Fig.1 Application of carbon source efficient utilization strategy(a)partial biosynthetic pathway of L?lysine in Corynebacterium glutamicum;(b)biosynthetic pathway of L?3,4?dihydroxyphenylalanine in E.coli;(c)biosynthetic pathway of S?adenosylmethionine in B.amyloliquefaciens;(d)biosynthetic pathway of 4?hydroxyisoleucine in E.coli

在現(xiàn)階段的很多研究中，最常利用過(guò)表達(dá)某些基因的方法提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，但在連續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程中容易發(fā)生質(zhì)粒的丟失[27]，且用于過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒會(huì)給細(xì)胞本身帶來(lái)代謝負(fù)擔(dān)[28]，導(dǎo)致較低的碳源利用率和較低的生產(chǎn)效率，Koma 等[29]通過(guò)染色體工程利用基因整合構(gòu)建了PtyrR（tyrR 啟動(dòng)子）和T7RP（T7 啟動(dòng)子控制下的RNA 聚合酶）/PT7lac（T7 啟動(dòng)子和lac 操縱子序列組成的T7lac 啟動(dòng)子）偶聯(lián)的組成型過(guò)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)苯丙氨酸，結(jié)果顯示，基于質(zhì)粒的在T7 啟動(dòng)子控制下的誘導(dǎo)型苯丙氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌MG1655 在生長(zhǎng)階段的生長(zhǎng)速率為0.22 h?1，生產(chǎn)階段的生長(zhǎng)速率僅為0.09 h?1，而基于染色體的在T7 啟動(dòng)子控制下的組成型苯丙氨酸生產(chǎn)菌株M?PAR?200 在相同條件下，生長(zhǎng)階段和生產(chǎn)階段的生長(zhǎng)速率均為0.30 h?1，另外，在發(fā)酵培養(yǎng)30 h 后，菌株大腸桿菌MG1655 的苯丙氨酸產(chǎn)量?jī)H為0.3 g/L，而菌株M?PAR?200 在發(fā)酵培養(yǎng)27 h 后產(chǎn)量就已達(dá)到1.4 g/L。通過(guò)染色體重組構(gòu)建組成型的表達(dá)系統(tǒng)會(huì)減輕菌體的代謝負(fù)擔(dān)，提高碳源利用率并改善菌株生產(chǎn)。這種方法還減少了高價(jià)誘導(dǎo)劑和抗生素的使用，具有廣闊的應(yīng)用前景[29]。

另外，為了提高碳源利用率，將目標(biāo)化合物的生產(chǎn)與工程細(xì)胞的生長(zhǎng)相耦合，以生長(zhǎng)為驅(qū)動(dòng)力驅(qū)動(dòng)細(xì)胞生產(chǎn)的方式也逐漸受到關(guān)注。有氧條件下，微生物通常利用糖酵解及三羧酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)，TCA 循環(huán)中的一些化合物往往是目標(biāo)產(chǎn)物的重要中間體，如果為擴(kuò)大該中間體的通量而抑制甚至截?cái)郥CA 循環(huán)會(huì)使細(xì)胞的生長(zhǎng)受阻，也不利于目標(biāo)化合物的生產(chǎn)[30]。Ruan等[31]在研究利用解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）生產(chǎn)S?腺苷甲硫氨酸的研究中指出，TCA 循環(huán)的中間體琥珀酰?CoA 能夠在高絲氨酸O?琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（metA）的催化下與高絲氨酸合成O?琥珀酰高絲氨酸，O?琥珀酰高絲氨酸在胱硫醚?γ?半胱氨酸酶（metB）的催化下分解為胱硫醚和琥珀酸，胱硫醚進(jìn)一步合成目標(biāo)產(chǎn)物S?腺苷甲硫氨酸，而琥珀酸重新進(jìn)入TCA循環(huán)，當(dāng)敲除TCA 循環(huán)中琥珀酰?CoA 合成酶基因sucC（催化琥珀酰?CoA 轉(zhuǎn)化為琥珀酸）時(shí)，細(xì)胞不僅能夠正常生長(zhǎng)，且由于更多的底物琥珀酰?CoA進(jìn)入到S?腺苷甲硫氨酸的合成途徑當(dāng)中，S?腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)量達(dá)到107.47 mg/L，GC?MS分析表明與敲除sucC 之前相比，下游代謝產(chǎn)物蛋氨酸產(chǎn)量增加了41%。這種耦合方式巧妙共用了部分TCA 循環(huán)，實(shí)現(xiàn)了碳源有效利用和目標(biāo)產(chǎn)物增加的雙贏[圖1(c)]。無(wú)獨(dú)有偶，俄羅斯學(xué)者Smirnov 等[32]在對(duì)大腸桿菌（E.coli）中合成4?羥基異亮氨酸（4?HIL）的研究中也利用了與TCA 循環(huán)耦合的方法，4?HIL 是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，由于其2S、3R、4S的特異構(gòu)型嚴(yán)格取決于葡萄糖的濃度發(fā)揮其促胰島素作用，可用于治療和預(yù)防2?型糖尿病。L?異亮氨酸?4?羥化酶（IDO）因其立體特異性的催化特點(diǎn)而被關(guān)注，在該酶的催化下，TCA循環(huán)中的α?酮戊二酸與L?異亮氨酸被轉(zhuǎn)化為琥珀酸和4?HIL，在缺失α?酮戊二酸脫氫酶基因sucAB 及異檸檬酸連接酶和異檸檬酸脫氫酶激酶基因aceAK 的菌株中，細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)，并且底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到82%，發(fā)酵培養(yǎng)22 h 后4?HIL 的產(chǎn)量達(dá)到24.1 g/L[圖1(d)]。

雖然非PTS 系統(tǒng)有利于節(jié)省PEP，降低丙酮酸的積累，在利用微生物生產(chǎn)芳香族氨基酸方面更具優(yōu)勢(shì)，但該系統(tǒng)攝取葡萄糖的效率較低，限制了產(chǎn)物的產(chǎn)量和菌株的生產(chǎn)能力。目前有研究篩選了更高效的非PTS系統(tǒng)攝取葡萄糖的相關(guān)蛋白以提高該系統(tǒng)的葡萄糖攝取能力，如來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)蛋白Glf（由glf 編碼）可更高效地轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖[33]。另一方面，由于大規(guī)模商業(yè)化發(fā)酵對(duì)低成本的要求[34]，氨基酸的生產(chǎn)傾向于選擇更廉價(jià)的碳源，如CO2、乙酸和甲醇等[35?39]，盡管目前這些碳源高效利用的研究還處于起步階段，利用率較低，且與葡萄糖共利用時(shí)由于阻遏導(dǎo)致共利用困難，但是為利用廉價(jià)碳源生產(chǎn)氨基酸及其衍生物奠定了理論基礎(chǔ)。

1.2 限速步驟的調(diào)節(jié)

在利用基因工程方法改造底盤(pán)菌株代謝途徑時(shí)，往往有一些限速步驟抑制通路的活性，找到并解除限速步驟是提高產(chǎn)量的關(guān)鍵[40]。Li 等[41]在從頭合成能夠誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)并增強(qiáng)植物對(duì)疾病的抵抗能力的高絲氨酸時(shí)發(fā)現(xiàn)，即使敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑以及高絲氨酸的分解代謝途徑后，高絲氨酸的產(chǎn)率仍然很低。經(jīng)過(guò)不同基因型的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)將天冬氨酸半醛還原為高絲氨酸的反應(yīng)是高絲氨酸高效生產(chǎn)中的限速步驟，過(guò)表達(dá)thrA（編碼高絲氨酸脫氫酶Ⅰ）或者metL（編碼高絲氨酸脫氫酶Ⅱ）能有效提高高絲氨酸的產(chǎn)量。在44 h 分批補(bǔ)料培養(yǎng)后分別檢測(cè)到1.20 g/L（過(guò)表達(dá)thrA）和1.04 g/L（過(guò)表達(dá)metL）的高絲氨酸，分別是未過(guò)表達(dá)高絲氨酸脫氫酶菌株產(chǎn)量的3 倍和2.6 倍[圖2(a)]。在合成抗癲癇藥物左乙拉西坦和溴西拉坦的直接前體L?高丙氨酸的研究中，由于谷氨酸脫氫酶（GDH）對(duì)谷氨酸生物合成的催化活性比對(duì)谷氨酸降解的催化活性高20倍以上，為了提高2?酮丁酸生成L?高丙氨酸的轉(zhuǎn)化率[42]，利用谷氨酸脫氫酶替代大腸桿菌（E.coli）內(nèi)源的轉(zhuǎn)氨酶，并以谷氨酸脫氫酶為模板進(jìn)行定向蛋白質(zhì)工程改造，具有K92V 和T195S 突變的GDH2 突變體顯示出最高的生產(chǎn)率，對(duì)比未定向進(jìn)化的GDH 使2?酮丁酸向L?高丙氨酸的轉(zhuǎn)化率提高了300%以上，通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造的方法克服了這一代謝瓶頸，發(fā)酵生產(chǎn)得到了5.4 g/L的L?高丙氨酸。

圖2 限速步驟調(diào)節(jié)策略的應(yīng)用(a)高絲氨酸在大腸桿菌中的生產(chǎn)代謝途徑;(b)L?精氨酸在谷氨酸棒狀桿菌中的生產(chǎn)代謝途徑;(c)5?羥基色氨酸在大腸桿菌中的生產(chǎn)代謝途徑aspC—天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因;asd—天門(mén)冬氨酸半醛脫氫酶基因;lysA—二氨基庚二酸酯脫羧酶基因;thrA—高絲氨酸脫氫酶I基因;metL—高絲氨酸脫氫酶II基因;thrBC—高絲氨酸激酶基因;metA—高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因;gdh—谷氨酸脫氫酶基因;argB—N?乙酰谷氨酸激酶基因;argC—N?乙酰?γ?谷氨酰磷酸還原酶基因;argD—乙酰鳥(niǎo)氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因;argJ—雙功能鳥(niǎo)氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因;argF—鳥(niǎo)氨酸氨基甲?；D(zhuǎn)移酶基因;argG—精氨酸琥珀酸合酶基因;argH—精氨酸琥珀酸合酶基因;pntAB—膜結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶基因;ppnK—NAD+激酶基因;DNMR—二氫莫那還原酶;P4H—苯丙氨酸4?羥化酶;PCD—蝶呤4a?甲醇胺脫水酶Fig.2 Application of speed?limiting step adjustment strategy(a)the metabolic pathway of homoserine production in E.coli;(b)the metabolic pathway of L?arginine in C.glutamicum;(c)the metabolic pathway of 5?hydroxytryptophan in E.coli

胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)在氨基酸及其衍生物的生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用，當(dāng)胞內(nèi)還原力過(guò)低無(wú)法參與中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物的生成反應(yīng)時(shí)，會(huì)成為氨基酸合成的限速步驟，因此，增加細(xì)胞還原力以提高目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)也是常用的調(diào)控策略。L?精氨酸具有舒張因子的作用，在臨床上常被用于擴(kuò)張血管[43?44]。以葡萄糖為底物每生成1 mol L?精氨酸的過(guò)程中需要3 mol 輔因子NADPH，而正常的有氧呼吸產(chǎn)生的NADPH 不足以大量生產(chǎn)L?精氨酸[45]，如何擴(kuò)大工程菌的NADPH 池成為亟需解決的問(wèn)題。Zhan 等[45]在谷氨酸棒狀桿菌（C.glutamicum）中過(guò)表達(dá)了來(lái)自大腸桿菌（E.coli）的膜結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶基因pntAB，使NADP+在NADH 的還原下轉(zhuǎn)化為NADPH，同時(shí)過(guò)表達(dá)了谷氨酸棒狀桿菌（C.glutamicum）自身的NAD+激酶基因ppnK，使用ATP 和多聚磷酸鹽作為磷?；w從NAD+產(chǎn)生NADP+，使細(xì)胞內(nèi)NADPH 的含量較原始菌株提高了51%，也使L?精氨酸的生產(chǎn)率提高了31%，產(chǎn)量達(dá)到61.13 g/L[圖2(b)]。類似地，1 mol L?賴氨酸的生成需要4 mol 的NADPH。在過(guò)去的研究中，主要以增加流向戊糖磷酸途徑（PPP）的通量來(lái)產(chǎn)生更多的NADPH，而這一方法的缺陷是導(dǎo)致不可避免的碳損失。Bommareddy 等[46]通過(guò)蛋白質(zhì)工程重新設(shè)計(jì)了來(lái)自谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum）的3?磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，由gapA 編碼），通過(guò)D35G/ L36T/T37K/ P192S 的四重突變使高度NAD+特異性的脫氫酶能夠以很高的親和力與NADP+結(jié)合，該酶可通過(guò)將3?磷酸甘油醛氧化為1,3?二磷酸甘油酸酯的反應(yīng)生成NADPH，極大地緩解了NADPH 缺乏的問(wèn)題，使谷氨酸棒狀桿菌（C.glutamicum）生產(chǎn)L?賴氨酸的產(chǎn)量與對(duì)照菌株比較提高了60%，達(dá)到8.76 g/L。

除了涉及呼吸鏈上的氧化還原平衡外，代謝途徑中某些特殊輔酶的供應(yīng)也可能成為代謝步驟的重要限速因素。Lin 等[47]在研究大腸桿菌（E.coli）體內(nèi)從頭合成5?羥基色氨酸（5?HTP）時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌中的幾種芳香族氨基酸羥化酶不能催化L?色氨酸5位碳原子的羥基化，因此通過(guò)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，比對(duì)原核生物P4Hs（編碼苯丙氨酸4?羥化酶）和動(dòng)物芳香族氨基酸羥化酶的方法，發(fā)現(xiàn)來(lái)自野油菜的P4H（XcP4H）對(duì)色氨酸表現(xiàn)出最高的活性。在此基礎(chǔ)上，利用蛋白質(zhì)工程對(duì)XcP4H 的幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行了合理的改造（L98Y、Y231C、W179F），最終XcP4H 的W179F 突變體顯示出更好的色氨酸選擇性，但該酶需要四氫生物蝶呤BH4 作為輔酶起催化作用，由于大多數(shù)細(xì)菌中都不自然產(chǎn)生BH4，而B(niǎo)H4 再生系統(tǒng)需要外源表達(dá)五種酶，會(huì)加重菌體負(fù)擔(dān)并帶來(lái)碳損失。而四氫單胞菌素MH4 是大腸桿菌中蝶呤存在的主要形式，有研究表明MH4可代替BH4 作為XcP4H 的輔酶[48]。因此，將定向進(jìn)化的XcP4H 與輔酶MH4 再生系統(tǒng)[phhB，來(lái)自銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），編碼蝶呤4a?甲醇胺脫水酶PCD，負(fù)責(zé)二氫單蝶呤的再生；folM，來(lái)自大腸桿菌（E.coli）,編碼二氫莫那還原酶DHMR]共表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)了5?HTP 在大腸桿菌中的生物合成，5?HTP搖瓶產(chǎn)量達(dá)到1.11 g/L[圖2(c)]。

限速步驟通常需要大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行定位分析[49]。常用的方法包括：（1）基因組規(guī)模的代謝模型，該方法能夠?qū)⒋x基因與代謝途徑關(guān)聯(lián)起來(lái)，為進(jìn)一步研究提供更精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)[50]；（2）同位素示蹤法也是較常使用的定位限速步驟的方法，該方法在代謝組學(xué)中的應(yīng)用有助于更直觀地分析目標(biāo)化合物的代謝通量[51]；（3）DNA 微陣列研究和RNA 測(cè)序能夠得到全面的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，直觀地獲取相關(guān)基因表達(dá)水平的數(shù)據(jù)[52]；（4）蛋白質(zhì)組學(xué)分析更能代表實(shí)際的代謝活動(dòng)，使人們能夠理解翻譯后修飾及其對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的影響[53]。目前定位限速步驟常常受限于缺乏對(duì)底盤(pán)菌株復(fù)雜調(diào)控系統(tǒng)的了解，或非模式生物無(wú)成熟的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行組學(xué)分析，因此，對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)更全面、多方位的精細(xì)研究是未來(lái)的研究熱點(diǎn)[54?55]。另一方面，目前最常利用過(guò)表達(dá)限速酶的方法解除限速步驟或?qū)ふ掖呋摬襟E的同工酶，但是效果有限[2,56]。因此，加強(qiáng)對(duì)代謝通路中的關(guān)鍵酶進(jìn)行基礎(chǔ)研究，利用蛋白質(zhì)工程等策略從基礎(chǔ)上提高酶的催化活性更有利于解除限速步驟[57?58]。

1.3 碳通量的調(diào)節(jié)

細(xì)胞內(nèi)諸多復(fù)雜的代謝途徑與目標(biāo)產(chǎn)物代謝途徑搶奪碳源導(dǎo)致碳流量分散，如何將碳通量盡可能多地引向目標(biāo)產(chǎn)物，對(duì)提高產(chǎn)率至關(guān)重要。敲除目標(biāo)產(chǎn)物降解途徑及提高前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率是改善目標(biāo)化合物生產(chǎn)的有效方式[59]。Zhang 等[60]在谷氨酸棒狀桿菌（C. glutamicum）生產(chǎn)L?鳥(niǎo)氨酸的研究中，為了阻止L?鳥(niǎo)氨酸的降解，敲除了將L?鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化成瓜氨酸的基因（argF），該菌株在72 h 生產(chǎn)了7.97 g/L L?鳥(niǎo)氨酸，比未敲除菌株提高了16 倍。為了增加L?鳥(niǎo)氨酸前體物質(zhì)谷氨酸的供應(yīng)，通過(guò)下調(diào)丙酮酸脫氫酶的表達(dá)，降低α?酮戊二酸向琥珀酰輔酶A 的轉(zhuǎn)化，使更多的碳通量流向谷氨酸以生成目標(biāo)產(chǎn)物，L?鳥(niǎo)氨酸的產(chǎn)量達(dá)到16 g/L[圖3(a)]。Arense等[61]在大腸桿菌（E.coli）高效生產(chǎn)左旋肉堿的研究中，為防止主要前體物質(zhì)巴豆甜菜堿經(jīng)肉堿呼吸途徑轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物γ?丁甜菜堿，敲除了編碼巴豆甜菜堿?CoA 還原酶的基因caiA，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果顯示左旋肉堿的產(chǎn)量提高42%，產(chǎn)量達(dá)到61.3 g/L，且上清液中沒(méi)有檢測(cè)到γ?丁甜菜堿積累，證明該策略有效地阻止了碳通量流向副產(chǎn)物。β?丙氨酸是自然界中發(fā)現(xiàn)的唯一一種β?氨基酸，是生物體中生產(chǎn)泛酸的主要前體。Zou 等[27]構(gòu)建了從頭合成β?丙氨酸的生物合成途徑，通過(guò)敲除競(jìng)爭(zhēng)性分支途徑來(lái)抑制丙酮酸、乙酰輔酶A、α?酮戊二酸向其下游副產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，使碳通量最大限度地集中于糖酵解和TCA 循環(huán)，以增強(qiáng)β?丙氨酸的前體天冬氨酸的合成，最佳生產(chǎn)菌株在補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中可合成43.12 g/L的β?丙氨酸[圖3(b)]。Rohles 等[62]在谷氨酸棒狀桿菌（C.glutamicum）中異源表達(dá)了來(lái)自惡臭假單胞菌（Corynebacterium glutamicum）的基因davB（編碼賴氨酸單加氧酶）和davA（編碼5?氨基戊酰胺酶），實(shí)現(xiàn)了5?氨基戊酸酯（5?AVA）的生產(chǎn)，但發(fā)酵結(jié)果顯示5?AVA 的產(chǎn)量只有12.7 g/L，并觀察到少量前體物質(zhì)L?賴氨酸和下游產(chǎn)品L?谷氨酸的大量積累。為了進(jìn)一步提高產(chǎn)量，研究者們敲除L?賴氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因抑制其外排，同時(shí)還敲除了該菌內(nèi)源的催化5?AVA 轉(zhuǎn)化為谷氨酸半醛的5?氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶基因（NCgl0462），該策略成功地將5?AVA 的產(chǎn)量提高到了28 g/L。Feng 等[63]通過(guò)在谷氨酸棒狀桿菌（C. glutamicum）中引入來(lái)自球形紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）的5?氨基乙酰丙酸合酶HemA 實(shí)現(xiàn)了5?氨基乙酰丙酸（5?ALA）的生產(chǎn)，并通過(guò)敲除基因ldhA（編碼L?乳酸脫氫酶）、pta（編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶）、pqo（編碼丙酮酸鹽:甲萘醌氧化還原酶）以及cat（乙酰?CoA 轉(zhuǎn)移酶）消除了副產(chǎn)物乳酸和乙酸的產(chǎn)生，使5?ALA 的產(chǎn)量達(dá)到了1.92 g/L。在此基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步增加前體草酰乙酸的供應(yīng)，通過(guò)過(guò)表達(dá)基因ppc（編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）并敲除基因pck（編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶）將5?ALA 的產(chǎn)量提高到了2.06 g/L。

(a)L?鳥(niǎo)氨酸在谷氨酸棒狀桿菌中的生產(chǎn)代謝途徑;(b)β?鳥(niǎo)氨酸在大腸桿菌中的生產(chǎn)代謝途徑odhA—酮戊二酸脫氫酶基因;argCJBD—精氨酸合成的操縱子基因;argF—鳥(niǎo)氨酸氨基甲?；D(zhuǎn)移酶基因;標(biāo)記紫色為下調(diào)基因,綠色為過(guò)表達(dá)基因,紅色為被敲除基因;ldhA—D?乳酸脫氫酶基因;pflB—丙酮酸甲酸酯裂解酶基因;adhE—酒精/醛脫氫酶基因;pta—磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶基因;gluDH—谷氨酸脫氫酶;akI,akII和akIII—天冬氨酸激酶基因;BtADC—L?天冬氨酸α?脫羧酶;AspA—天冬氨酸酶;標(biāo)記藍(lán)色箭頭表示基因圖3 碳通量調(diào)節(jié)策略的應(yīng)用過(guò)表達(dá),紅色箭頭表示基因敲除Fig.3 Application of carbon flux regulation strategy(a)the metabolic pathway of L?ornithine in C.glutamicum;(b)production and metabolism pathway of β?ornithine in E.coli

在碳源充足的基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)碳通量使更多的碳代謝流引入目標(biāo)代謝途徑可有效增加目標(biāo)產(chǎn)物的得率。通過(guò)增加前體物質(zhì)的供應(yīng)及阻斷產(chǎn)物的分解代謝途徑等方法調(diào)節(jié)微生物細(xì)胞內(nèi)的碳通量是常用的重新分配碳代謝流的方法[30,64]。但在人為引導(dǎo)碳通量的過(guò)程中，某些中間產(chǎn)物的大量積累會(huì)降低目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率，甚至?xí)种萍?xì)胞的正常生長(zhǎng)[65?67]。因此，利用模塊優(yōu)化平衡碳代謝流或利用動(dòng)態(tài)調(diào)控的方法實(shí)時(shí)對(duì)胞內(nèi)碳流量進(jìn)行動(dòng)態(tài)分配成為解決該問(wèn)題的常用手段。這些研究為氨基酸及其衍生物的生物合成提供了技術(shù)支持和理論支撐[68?70]。

1.4 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與反饋抑制調(diào)節(jié)

在氨基酸的天然合成過(guò)程中，反饋抑制調(diào)節(jié)是細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)方式，可以防止細(xì)胞內(nèi)碳源的不必要損失和氨基酸的過(guò)量積累。而在微生物合成氨基酸的過(guò)程中，為了實(shí)現(xiàn)某種氨基酸的高產(chǎn)則需要解除反饋抑制。因此，在改良菌株生產(chǎn)性能的過(guò)程中，解除代謝通路上一些關(guān)鍵酶的反饋抑制作用是非常有效的策略。生產(chǎn)芳香族氨基酸的第一步即由磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）與4?磷酸赤蘚糖（E?4P）在3?脫氧?α ?阿拉伯庚酮糖?7?磷酸合酶（DAHP 合酶）的催化下生成DAHP 的反應(yīng)非常關(guān)鍵，在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中存在Aro4（由ARO4 編碼）行使DAHP 合酶催化活性，而Aro4受到酪氨酸的反饋抑制[71]，另外，中間步驟分支酸分解為鄰氨基苯甲酸酯和苯甲酸酯的反應(yīng)由分支酸突變酶Aro7（由ARO7 編碼）催化，其中Aro7 也受到酪氨酸的抑制[72]。Luttik 等[73]利用釀酒酵母（S.cerevisiae）生產(chǎn)酪氨酸的研究中，通過(guò)表達(dá)經(jīng)蛋白質(zhì)工程改造后的兩種反饋抑制酶的等位基因ARO4K229L 和ARO7G141S，解除了產(chǎn)物酪氨酸對(duì)起關(guān)鍵作用的DAHP 合酶和分支酸突變酶的反饋抑制，將酪氨酸的產(chǎn)量提高了3倍，達(dá)到36.2 mg/L。在大腸桿菌（E.coli）合成非天然氨基酸2?氨基丁酸的研究中[74]，L?蘇氨酸先經(jīng)蘇氨酸脫水酶（ilvA）催化生成2?酮丁酸（2?KB），再在脫氫酶的作用下生成2?氨基丁酸，而2?KB 代謝生成的副產(chǎn)物L(fēng)?異亮氨酸對(duì)ilvA 有較強(qiáng)的抑制作用，蘇氨酸脫水酶的5 突變體（IlvAG1054TC1055TT1084CT1085GC1086T）基因ilvA *受到的反饋抑制作用顯著減弱，2?KB 的產(chǎn)量提高了1 倍，達(dá)到8.05 g/L，進(jìn)一步表達(dá)2?酮丁酸脫氫酶后得到5.39 g/L的2?氨基丁酸[圖4(a)]。Park等[75]在利用谷氨酸棒狀桿菌（C. glutamicum）生產(chǎn)L?精氨酸的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)L?精氨酸的濃度超過(guò)閾值后，精氨酸阻遏物ArgR（由argR 編碼）會(huì)與arg 操縱子結(jié)合抑制L?精氨酸的生物合成[76]，而脂肪?；憫?yīng)調(diào)節(jié)子FarR 則會(huì)抑制精氨酸合成基因簇argBCGH 以及谷氨酸脫氫酶基因gdh 的表達(dá)，從而對(duì)L?精氨酸的生物合成產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。因此，在同時(shí)敲除調(diào)控基因argR 和farR，解除負(fù)調(diào)控作用的菌株的分批補(bǔ)料發(fā)酵中，L?精氨酸產(chǎn)量達(dá)到61.9 g/L，與對(duì)照菌株相比，產(chǎn)量提高了120%。在L?亮氨酸生產(chǎn)過(guò)程中，第一步反應(yīng)是2?酮異戊酸和乙酰輔酶A 在蘋(píng)果酸2?異丙基蘋(píng)果酸合酶IPMS 催化（由leuA 編碼）下轉(zhuǎn)化為2?異丙基蘋(píng)果酸和CoA，其中，基因leuA 的表達(dá)受到L?亮氨酸的反饋抑制。為了實(shí)現(xiàn)L?亮氨酸的高效生產(chǎn)，Vogt 等[22]通過(guò)基因工程定點(diǎn)突變了IPMS中的兩個(gè)氨基酸(G1586A,G1595A)，突變菌株B018中的leuA 基因表達(dá)的蛋白酶催化能力未受影響，但不再受到L?亮氨酸的反饋抑制。另外轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子LtbR 在L?亮氨酸濃度較高的情況下會(huì)抑制基因leuCD（編碼3?異丙基蘋(píng)果酸脫水酶）和基因leuB（編碼L?亮氨酸合成酶）的表達(dá)。通過(guò)解除leuA 受到的反饋抑制作用和敲除轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因ltbR，工程菌中L?亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到5.7 g/L，較野生型菌株產(chǎn)量增加了10%[圖4(b)]。Ding 等[77]研究了全局調(diào)控因子（ArcA、Cra、IclR）和L?蘇氨酸內(nèi)轉(zhuǎn)蛋白TdcC（由tdcC 編碼）在大腸桿菌高效合成L?蘇氨酸中的作用，全局調(diào)節(jié)劑ArcA 在葡萄糖充足的條件下對(duì)有氧TCA 循環(huán)中基因的表達(dá)具有抑制作用，cra 的過(guò)表達(dá)可明顯增加葡萄糖的消耗，而cra 的缺失并不能提高葡萄糖的消耗速率，iclR 的缺失可以激活乙醛酸分流，促使更多的草酰乙酸可以轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)?蘇氨酸，在分批補(bǔ)料培養(yǎng)中突變體TWF018（ΔarcAΔiclRΔtdcC）得到了最高的蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到26.0 g/L，相對(duì)于原始菌株增加了109.7%。

(a)2?氨基丁酸在大腸桿菌中的生產(chǎn)代謝途徑;(b)L?亮氨酸在谷氨酸棒狀桿菌中的生產(chǎn)代謝途徑ilvA—蘇氨酸脫水酶基因;ilvIH—乙酰羥酸合酶Ⅲ基因;leuDH—2?酮丁酸脫氫酶基因;減號(hào)表示受到抑制,虛線表示反饋抑制,標(biāo)記藍(lán)色箭頭表示過(guò)表達(dá);leuA—2?異丙基蘋(píng)果酸合酶(IPMS)基因;leuCD—3?異丙基蘋(píng)果酸脫水酶(IPMD)基因;leuB—3?異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶(IPMDH)基因;ilvE—支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAAT)基因Fig.4 Application of transcription regulation and feedback inhibition regulation strategies(a)the metabolic pathway of 2?aminobutyric acid in E.coli;(b)L?leucine production and metabolic pathways in C.glutamicum圖4 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與反饋抑制調(diào)節(jié)策略的應(yīng)用

綜上所述，代謝網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控因子對(duì)產(chǎn)物的高效生產(chǎn)起到重要的作用，但調(diào)控因子的作用機(jī)制較為復(fù)雜，有些調(diào)控因子可同時(shí)對(duì)同一個(gè)代謝途徑的多個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)生干預(yù)，如酪氨酸對(duì)DAHP 合酶及分支酸變位酶均有抑制作用，L?蛋氨酸合成途徑上的轉(zhuǎn)錄阻遏物MetJ 對(duì)上游中間代謝途徑的抑制[73,78]；有些調(diào)控因子同時(shí)控制多個(gè)代謝途徑的表達(dá)和調(diào)控，如抗生素抗性調(diào)節(jié)劑、乳糖阻遏蛋白和λ阻遏物等對(duì)多個(gè)代謝途徑的調(diào)節(jié)[79?81]；而有些基因的表達(dá)則受多個(gè)調(diào)控因子的共同干預(yù)[82?83]。因此，需要對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全面的了解和分析。隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等研究的不斷進(jìn)展，數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，將為轉(zhuǎn)錄和反饋抑制調(diào)節(jié)提供更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，從而更精確地對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行干預(yù)和調(diào)控。

1.5 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)

理想的發(fā)酵產(chǎn)品是能夠在胞內(nèi)源源不斷地生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)并及時(shí)排出到培養(yǎng)基中，以方便進(jìn)行后續(xù)的分離純化工作。但存在一些產(chǎn)物被生產(chǎn)并排出細(xì)胞后，能被工程菌重吸收到胞內(nèi)或產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)外排能力較弱導(dǎo)致的胞內(nèi)積累問(wèn)題。解決胞內(nèi)積累問(wèn)題不僅可以緩解反饋抑制，還可以降低產(chǎn)物產(chǎn)生細(xì)胞毒性，減少后續(xù)分離純化步驟。因此，對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)物的研究極為重要。Yin 等[84]發(fā)現(xiàn)外排蛋白對(duì)L?異亮氨酸的高效生產(chǎn)有著十分重要的作用，外排蛋白BrnFE 的過(guò)表達(dá)能夠有效提升L?異亮氨酸的產(chǎn)量，來(lái)源于谷氨酸棒狀桿菌（C. glutamicum）的全局調(diào)節(jié)因子Lrp 能夠激活谷氨酸棒狀桿菌（C.glutamicum）中BrnFE 的表達(dá)，共表達(dá)lrp 和brnFE 的菌株在經(jīng)過(guò)72 h 發(fā)酵后，L?異亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了26.8 g/L，與初始菌株相比產(chǎn)量提高了63%，但是由于BrnFE 不具特異性，對(duì)L?纈氨酸、L?亮氨酸和L?蛋氨酸三種支鏈氨基酸（BCAA）均有外排作用，因此也增加副產(chǎn)物的量。Li等[41]發(fā)現(xiàn)高濃度的胞內(nèi)高絲氨酸積累會(huì)給細(xì)胞生長(zhǎng)帶來(lái)負(fù)擔(dān)，通過(guò)過(guò)表達(dá)高絲氨酸外排蛋白的編碼基因rhtA以及敲除基因tdcC（編碼一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠攝取胞外高絲氨酸）可使胞內(nèi)高絲氨酸濃度保持在較低水平，大大降低了高絲氨酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，從而顯著提高了目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，最終在分批補(bǔ)料發(fā)酵中生產(chǎn)了39.54 g/L的高絲氨酸。L?半胱氨酸是一種含硫氨基酸，在制藥、化妝品、動(dòng)物飼料添加劑等領(lǐng)域有著廣泛地應(yīng)用，也在提高動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育方面起著重要作用[85]。但較高濃度的L?半胱氨酸可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)DNA 的氧化損傷，從而抑制細(xì)胞的正常生長(zhǎng)[86]，為了將產(chǎn)生的L?半胱氨酸及時(shí)排出胞外以減少對(duì)細(xì)胞的毒性，Wei 等[87]在谷氨酸棒狀桿菌（C. glutamicum）中分別表達(dá)了來(lái)自大腸桿菌（E.coli）及菠蘿假單胞菌（Pantoea ananatis）的L?半胱氨酸外轉(zhuǎn)蛋白Bcr和CefA，發(fā)酵結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)Bcr的菌株L?半胱氨酸的產(chǎn)量最高，達(dá)到634.4 mg/L，比未表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的菌株產(chǎn)量提高了88.9%。在從頭合成L?蛋氨酸的研究中，通過(guò)過(guò)表達(dá)L?蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因yjeH 以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)L?蛋氨酸的外排作用，將L?蛋氨酸的產(chǎn)量從202.64 mg/L 提高到413.16 mg/L。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)敲除L?蛋氨酸的內(nèi)轉(zhuǎn)蛋白MetD 基因阻止了L?蛋氨酸的重新攝入，進(jìn)一步使L?蛋氨酸的產(chǎn)量增加到593.5 mg/L[78]。Lubitz等[88]發(fā)現(xiàn)外排蛋白LysE對(duì)L?瓜氨酸的積累有重要影響，與原始菌株相比，過(guò)表達(dá)lysE 基因使L?瓜氨酸的產(chǎn)量提高了45%，達(dá)到21 g/L，而lysE 的缺失菌株中L?瓜氨酸的產(chǎn)量減少了1 半，因此過(guò)表達(dá)lysE 是提高L?瓜氨酸產(chǎn)量的有效策略。Simic 等[89]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)L?蘇氨酸外排蛋白基因thrE 的發(fā)酵液中積累了8.1g/L 的L?蘇氨酸，相對(duì)于未過(guò)表達(dá)thrE菌株產(chǎn)量提高了40%。

表1 本文涉及到的氨基酸及其衍生物摘要Table 1 Summary of amino acids and their derivatives involved in this article

在菌株的優(yōu)化策略中，中間體及目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控方法已經(jīng)越來(lái)越廣泛地被用于改善目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)，主要包括增加底物的攝入、減少中間體的外排流失、減少對(duì)產(chǎn)物的再攝取以及增加產(chǎn)物的外排幾方面[90]。但由于一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物特異性不強(qiáng)，在外排目標(biāo)產(chǎn)物的同時(shí)也導(dǎo)致其他副產(chǎn)物的外排，不僅分散了碳流，也為后續(xù)分離純化增加難度。如果通過(guò)合理的蛋白質(zhì)工程改造或挖掘更多的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有望能夠克服這些問(wèn)題，將為目標(biāo)氨基酸及其衍生物產(chǎn)量的提高作出更大貢獻(xiàn)。

本文涉及到的氨基酸及其衍生物匯總于表1。

2 展 望

隨著市場(chǎng)對(duì)氨基酸及其衍生物需求的不斷增長(zhǎng)，氨基酸生產(chǎn)市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)將日趨激烈，如何降低成本且提高產(chǎn)能是科研工作者不斷努力的方向。將微生物細(xì)胞作為平臺(tái)來(lái)生產(chǎn)氨基酸及其衍生物，順應(yīng)了可持續(xù)發(fā)展的大趨勢(shì)，也是一種有望代替化學(xué)法利用石油等不可再生資源的有前途的生產(chǎn)方式。大量科學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)通過(guò)構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠可實(shí)現(xiàn)多種氨基酸及其衍生物的生物合成。然而，目前大部分氨基酸及其衍生物如L?茶氨酸、γ?氨基丁酸等產(chǎn)品的微生物合成尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。產(chǎn)量、產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率是決定微生物細(xì)胞工廠能否實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。在細(xì)胞生長(zhǎng)最小化，產(chǎn)物合成最大化的原則上，設(shè)計(jì)最優(yōu)的生物合成途徑，避免副產(chǎn)物的積累，平衡合成過(guò)程中碳源、能量和還原力的供給，可顯著提高微生物細(xì)胞工廠的合成效率。隨著組學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷擴(kuò)大，代謝網(wǎng)絡(luò)集成式、模塊化的高效運(yùn)行策略的發(fā)展[91?92]，以及近年來(lái)新開(kāi)發(fā)的核糖開(kāi)關(guān)[93]、生物傳感器、CRISPR 基因編輯和RNA 干擾等技術(shù)為利用不同的代謝調(diào)控策略對(duì)底盤(pán)菌株進(jìn)行改造提供了更精準(zhǔn)、更先進(jìn)的方法[94]。相信在不斷豐富和發(fā)展的系統(tǒng)合成生物學(xué)領(lǐng)域，人工構(gòu)建的特定化工程生產(chǎn)菌株將克服更多的自然壁壘，將傳統(tǒng)的氨基酸生產(chǎn)擴(kuò)展到更多具有潛在價(jià)值的氨基酸衍生物方向上來(lái)，實(shí)現(xiàn)更廣泛的應(yīng)用并創(chuàng)造更大的價(jià)值[95]。