張生杰，龐文娟，王 麗

(武威市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 武威 733000)

白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗等功效，臨床用于治療頭痛眩暈、脅痛、腹痛、四肢攣痛、血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、自汗、盜汗等[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分主要包括單萜及其苷類、三萜類、黃酮、鞣質(zhì)、多糖、揮發(fā)油等物質(zhì)，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、抗癌、抗抑郁和抗肝纖維化等作用；對(duì)自身免疫性疾病、心腦血管疾病和神經(jīng)退行性疾病也能起到改善和治療作用[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，白芍通過阻斷Toll樣受體4/5信號(hào)通路，抑制樹突狀細(xì)胞的功能，從而減輕了免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[3]，白芍主要成分芍藥總苷可通過下調(diào)E1B19k/Bcl-2結(jié)合蛋白Nip3基因表達(dá)，上調(diào)Kruppel型鋅指蛋白、紫外切除修復(fù)蛋白R(shí)AD23同族體B和熱休克蛋白1基因表達(dá)來抑制腫瘤[4]，通過阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗肝纖維化作用[5]。不過盡管對(duì)白芍藥理學(xué)研究已有較多報(bào)道，但均未系統(tǒng)整體探討其成分、靶點(diǎn)、疾病、通路之間的相互聯(lián)系。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、調(diào)節(jié)方式多樣的特點(diǎn)，蘊(yùn)含了極大的信息量，采用西醫(yī)單靶標(biāo)、單成分的研究思路來研究中藥，很難體現(xiàn)中藥的系統(tǒng)性[6]。自2007年HOPKINS[7]首次提出了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)研究方法，該方法即廣泛應(yīng)用于闡釋中藥藥理機(jī)制[8]、探究中藥的毒性機(jī)制[9]等，改變了傳統(tǒng)新藥研發(fā)“一個(gè)藥物、一個(gè)靶標(biāo)、一種疾病”的理念。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用的基礎(chǔ)上，通過網(wǎng)絡(luò)分析，以網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)為切入點(diǎn)，從整體生物網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定角度分析藥物分子與疾病網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)聯(lián)。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析白芍藥理作用機(jī)制，為其開發(fā)利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)分析平臺(tái)，以“白芍”為關(guān)鍵詞檢索其活性成分及靶點(diǎn)。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，化合物類藥性(drug-like，DL)≥0.18為篩選條件，再結(jié)合文獻(xiàn)挖掘與整理，依據(jù)化合物在單味藥中的含量、研究熱度等標(biāo)準(zhǔn)篩選出已報(bào)道的白芍活性成分[10]。

1.2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將得到的白芍活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)通過UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/uploadlists/)翻譯成相應(yīng)基因，所有靶點(diǎn)均為人源化。再將化合物及相應(yīng)基因?qū)隒ytoscape3.6.1軟件，繪制白芍活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。在Cytoscape軟件網(wǎng)絡(luò)圖中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)是基因、蛋白或化合物，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接(edge)代表這些生物分子之間的相互關(guān)系，度值(degree)表示網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)之間的連接數(shù)目，化合物度值越大，說明該化合物與多個(gè)靶點(diǎn)有關(guān)系，在疾病治療中起關(guān)鍵作用。

1.3 靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過TCMSP平臺(tái)尋找與18個(gè)候選化合物相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，并根據(jù)得出的靶點(diǎn)在TCMSP平臺(tái)中找出相關(guān)的疾病，導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。用節(jié)點(diǎn)的大小和顏色表示degree值的大小，節(jié)點(diǎn)越大、顏色由黃到紅表示degree值越大；用粗細(xì)表示靶點(diǎn)與疾病之間的相互關(guān)系，邊越粗表示關(guān)系越緊密。

1.4 靶蛋白相互作用(PPI)

網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及hub基因篩選為明確白芍潛在靶蛋白之間的相互作用，將篩選得到的靶蛋白在STRING平臺(tái)(https：//string-db. org/)構(gòu)建蛋靶白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens(人類)”進(jìn)行操作，最低相互作用閾值設(shè)為中等置信度 0.4“medium confidence”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。以PPI網(wǎng)絡(luò)連線的粗細(xì)代表相互的強(qiáng)弱，靶點(diǎn)的度值(Degree)表示相互作用的靶點(diǎn)個(gè)數(shù)。將PPI網(wǎng)絡(luò)模型導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)分析CytoHubba插件篩選核心基因(hub gene)，采用最大集團(tuán)中心性(Maximal clique centrality，MCC)的拓?fù)渌惴ǎ诵幕驅(qū)?yīng)的蛋白質(zhì)即為具有重要生理調(diào)節(jié)功能的核心蛋白。

1.5 GO功能富集與KEGG信號(hào)通路分析

應(yīng)用基因注釋及功能富集數(shù)據(jù)庫 DAVID 6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)，對(duì)白芍潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(Gene ontology，GO)功能富集分析，研究藥物靶點(diǎn)生物過程，在京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，研究藥物靶點(diǎn)主要信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 白芍活性成分篩選

通過(TCMSP)篩選，得到白芍85個(gè)化合物分子中有14個(gè)符合條件，結(jié)合文獻(xiàn)挖掘與整理篩選出4個(gè)已報(bào)道的白芍活性成分丹皮酚[11]、熊果酸[12]、氧化芍藥苷[13]、沒食子酸甲酯[14]共計(jì)18個(gè)化合物作為候選化合物，見表1。

2.2 主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

在TCMSP平臺(tái)檢索18個(gè)候選化合物的作用靶點(diǎn)，其中12個(gè)化合物檢索出146個(gè)相應(yīng)靶點(diǎn)，6個(gè)化合物未檢索出對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，以此構(gòu)建白芍化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，包含106個(gè)節(jié)點(diǎn)、274條邊，其中12個(gè)紫色節(jié)點(diǎn)代表了白芍的活性成分，94個(gè)藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表了靶點(diǎn)，274條邊代表了化學(xué)成分與靶點(diǎn)的相互作用，通過活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)白芍中山柰酚、兒茶素、丹皮酚、芍藥苷、芍藥苷元、芍藥二酮、β-谷甾醇、谷甾醇、沒食子酸甲酯、齊墩果酸、反亞油酸甲酯、丁子香萜在白芍藥理中發(fā)揮了重要作用，見圖 1。

表1 白芍活性成分篩選結(jié)果

圖1 白芍活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

潛在靶點(diǎn)與相關(guān)疾病構(gòu)建的靶點(diǎn)-疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，由246個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括46個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)、200個(gè)疾病節(jié)點(diǎn)和378條邊組成，94個(gè)靶點(diǎn)中有48個(gè)靶點(diǎn)在靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖中沒有相對(duì)應(yīng)的疾病，說明還存在尚未被發(fā)現(xiàn)的作用途徑。網(wǎng)絡(luò)圖中PTGS2(前列腺素G /H合酶2)的degree值最大，與32種疾病相關(guān)，包括炎癥、惡性腫瘤、痛癥、心血管疾病等，這與現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)論相吻合[15-16]。又如PPARG(過氧化物酶體增生激活受體γ)參與調(diào)節(jié)了21種不同的疾病，包括胰腺癌、胰腺癌、膀胱癌、動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、炎癥、糖尿病、肥胖癥等。篩選出degree>3的17種疾病，乳腺癌(9)、非特異性癌癥(9)、哮喘(8)、慢性炎癥(8)、炎癥(6)、前列腺癌(6)、克羅恩氏病(5)、焦慮癥(5)、阿爾茨海默氏病(5)、心臟衰竭(4)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(4)、精神分裂癥(4)、胰腺癌(4)、膀胱癌(4)、糖尿病(4)、骨關(guān)節(jié)炎(4)、心肌梗塞(4)，由此可見，白芍在這些疾病的治療中發(fā)揮了一定作用，這與白芍抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗抑郁的功效相吻合。見圖2。

圖2 白芍靶點(diǎn)與疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及hub基因篩選

將白芍94個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為“人”，構(gòu)建蛋白相互作用關(guān)系，其中一些蛋白與其他蛋白沒有相互關(guān)系，將不再在相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中體現(xiàn)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。圖3中節(jié)點(diǎn)代表蛋白，邊表示蛋白之間的相互關(guān)系，共有87個(gè)節(jié)點(diǎn)、702條邊。用節(jié)點(diǎn)的大小和顏色表示degree值的大小，節(jié)點(diǎn)越大、顏色由紅到藍(lán)表示degree值越大，用邊的粗細(xì)表示蛋白之間的相互關(guān)系Combine-score，邊越粗表示Combine-score值越大，說明蛋白之間的關(guān)系越緊密。根據(jù)Cytoscape軟件Cytohubba插件，MCC算法計(jì)算前10個(gè)關(guān)鍵基因(AKT1、IL6、TNF、JUN、PTGS2、MAPK8、CASP3、MAPK1、ICAM1、VCAM1)，提示這些關(guān)鍵基因在白芍藥理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。見圖4。

2.5 GO生物過程富集結(jié)果

對(duì)白芍94個(gè)靶基因進(jìn)行GO生物過程富集，GO注釋分為三大類，分別是：分子生物學(xué)功能(Molecular function，MF)、生物學(xué)過程(Biological process，BP)和細(xì)胞學(xué)組分(Cellular components，CC)。通過這三個(gè)功能，對(duì)一個(gè)基因的功能進(jìn)行多方面的限定和描述[17]，通過DAVID數(shù)據(jù)庫以人類基因?yàn)楸尘皩?duì)白芍預(yù)測(cè)靶點(diǎn)GO進(jìn)行生物過程富集分析(P<0.05)，圖5-圖7分別列出了顯著性較高的10種。從結(jié)果來看白芍活性成分作用的靶點(diǎn)主要富集在分子功能的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡的調(diào)控、程序性細(xì)胞死亡的調(diào)控、細(xì)胞死亡的調(diào)控、細(xì)胞增殖調(diào)控等生物過程中，在細(xì)胞組成方面，細(xì)胞分子、不溶性組分、微粒體、泡狀部分、膜組分占比較高；在分子功能方面，腎上腺素受體活性、胺受體活性、α腎上腺素能受體活性、藥物結(jié)合排在前列。

圖3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因(hub)基因篩選

圖5 白芍活性成分靶點(diǎn)的BP富集分析(一)

圖6 白芍活性成分靶點(diǎn)的BP富集分析(二)

圖7 白芍活性成分靶點(diǎn)的BP富集分析(三)

2.6 KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果

對(duì)白芍94個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集，根據(jù)P<0.05篩選出前20條信號(hào)通路，分別為癌癥通路、Toll樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、NOD樣受體信號(hào)通路、前列腺癌、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、小細(xì)胞肺癌、II型糖尿病、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、結(jié)直腸癌、細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)代謝的影響、色氨酸代謝、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)途徑、胰腺癌、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、藥物代謝信號(hào)通路(圖8)。白芍可以通過Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路等途徑發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)的作用[18]，現(xiàn)已開發(fā)成上市藥物(白芍總苷膠囊)，常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[19]；也可以作用于癌癥的細(xì)胞凋亡、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等多條癌癥相關(guān)途徑以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡；通過細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)代謝的影響[20]、藥物代謝信號(hào)通路發(fā)揮保肝功效。表明白芍的活性成分可以作用于這些信號(hào)通路發(fā)揮藥理作用。

圖8 白芍靶點(diǎn)的KEGG通路

3 討論

白芍作為理氣止痛、疏肝解郁良藥，有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗抑郁功效，但作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析與中醫(yī)藥整體觀的思想基本一致，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法有助于闡釋白芍物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制。本研究檢索出白芍84個(gè)化學(xué)成分，通過條件篩選選出12個(gè)化合物作為白芍主要活性成分，且大多數(shù)都符合Lipinski五規(guī)則[21]，化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖顯示了白藥多成分、多靶點(diǎn)相互作用的特點(diǎn)，其主要通過山柰酚、兒茶素、丹皮酚、芍藥苷、芍藥苷元、芍藥二酮、β-谷甾醇、谷甾醇、沒食子酸甲酯、齊墩果酸、反亞油酸甲酯、丁子香萜發(fā)揮藥理作用。

藥物靶點(diǎn)被視為藥物在機(jī)體內(nèi)的作用結(jié)合位點(diǎn)，包括基因位點(diǎn)、受體、酶、離子通道、核酸等生物大分子等，選擇確定新穎的有效藥物靶點(diǎn)在新藥研發(fā)中具有重要意義[22]。對(duì)白芍靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)PTGS2、PPARG、TNF、HSP90AB1、ALOX5、CYP1A2等是白芍抗炎、疼痛、抗抑郁、抗腫瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)TNF、ADRB2、PDE3A、PPARG、CYP1A2、SELE、ALOX5多個(gè)靶點(diǎn)對(duì)哮喘有明確的相互作用，但目前并沒有與此相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，提示可以開展與其作用機(jī)制相關(guān)的研究，并將其運(yùn)用到臨床哮喘的治療，此外靶點(diǎn)PPARG、PTGS2、SELE、ALOX5對(duì)銀屑病具有靶向作用，TNF、HTR2A、PPARGV、DPP4、INSR對(duì)糖尿病具有靶向作用，這對(duì)研究開發(fā)白芍新的適應(yīng)證具有指導(dǎo)意義。

通過對(duì)白芍作用蛋白的相互作用分析，白芍靶蛋白之間是一個(gè)相互交錯(cuò)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并非單獨(dú)發(fā)揮作用。其中AKT1、PTGS2、TNF、JUN、VCAM1、CASP3、ICAM1、IL-6、MAPK8、MAPK1是治療疾病的核心靶點(diǎn)，白芍發(fā)揮藥理作用離不開這些關(guān)鍵靶蛋白的直接或者間接作用，如AKT1編碼的AKT蛋白細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路中的傳感器，在生長(zhǎng)因子或胰島素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要的角色，在營(yíng)養(yǎng)代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞存活中也具有重要作用[23]。ICAM1和VCAM1都是免疫球蛋白超家族成員，在炎癥性細(xì)胞因子作用下，其通常在內(nèi)皮細(xì)胞和免疫系統(tǒng)細(xì)胞上表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致炎癥分子的集中，從而產(chǎn)生炎癥，ICAM1在調(diào)解細(xì)胞與細(xì)胞間的炎癥反應(yīng)中起重要作用[24-25]。PTGS2可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素H2，PTGS2上調(diào)與細(xì)胞黏附增加、表型變化、細(xì)胞凋亡和腫瘤血管生成有關(guān)，具有抗炎抗氧化作用[26]，從而揭示白芍抗炎作用機(jī)制。此外，TNF是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一[27]，Caspases-3在細(xì)胞凋亡中具有不可替代的作用，IL-6能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖，分化并提高其功能對(duì)研究白芍抗腫瘤、提高免疫力具有重要的指導(dǎo)意義。

GO富集分析和KEGG通路注釋分析結(jié)果表明，白芍主要活性成分靶點(diǎn)主要通過分子功能正調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡的調(diào)控、程序性細(xì)胞死亡的調(diào)控、細(xì)胞死亡的調(diào)控、細(xì)胞增殖調(diào)控在細(xì)胞分子、不溶性組分、微粒體、泡狀部分、膜組分上發(fā)生腎上腺素受體活性、胺受體活性、α腎上腺素能受體活性、藥物結(jié)合等分子反應(yīng)。從KEGG信號(hào)通路富集來看，白芍主要涉及癌癥的途徑、Toll樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、NOD樣受體信號(hào)通路、前列腺癌、肌萎縮側(cè)索硬化癥、小細(xì)胞肺癌、Ⅱ型糖尿病、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等反應(yīng)，白芍主要通過這些信號(hào)通路發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝作用。此外白芍可以作用于肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、色氨酸代謝信號(hào)途徑，為開發(fā)治療肌肉萎縮新藥提供了途徑[28]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)也證明了這些信號(hào)通路的存在，在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，芍藥苷能夠抑制溶血卵磷脂誘導(dǎo)的炎性因子的產(chǎn)生，這種抑制作用與高遷移率族蛋白B1-晚期糖基化終產(chǎn)物/Toll樣受體2 /Toll樣受體4-NF-κB信號(hào)通路有關(guān)[29]。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究白芍物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用機(jī)制，符合中藥多成分、多靶點(diǎn)、調(diào)節(jié)方式多樣性的特點(diǎn)，上述預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與已知文獻(xiàn)報(bào)道的藥理作用相吻合，說明了預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性。不過現(xiàn)有文獻(xiàn)多集中在白藥抗炎機(jī)制的研究，對(duì)抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力方面的報(bào)道較少，今后需加強(qiáng)在這些方面的研究，為白芍的開發(fā)利用提供新的思路。