張道微 張圣海

(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031)

上世紀(jì)70代初，科學(xué)家曾假設(shè)外源性的DNA基因治療可能是一種有效的治療遺傳性疾病的方法。這種方法在理論上可以通過(guò)一次治療獲得持久的臨床療效。盡管從提出概念到臨床應(yīng)用的過(guò)程是漫長(zhǎng)而曲折，但基因治療已經(jīng)給越來(lái)越多的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)新的治療選擇。我們總結(jié)了視網(wǎng)膜相關(guān)疾病基因治療的現(xiàn)狀，重點(diǎn)關(guān)注幾種常見(jiàn)疾病的研究?jī)?nèi)容，并概述了這些新型治療方法的前景和局限性，以便相關(guān)研究人員參考。

1 視網(wǎng)膜疾病的基因治療進(jìn)展

幾十年來(lái)基因治療因其良好前景受到各領(lǐng)域的關(guān)注，相關(guān)研究者都希望借此幫助解決治療效果有限的問(wèn)題，但由于潛在風(fēng)險(xiǎn)、臨床轉(zhuǎn)化困難等原因，一直難以取得突破性進(jìn)展。直至2017年,第1例基因治療生物制劑CTL019獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)，用于治療復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病[1]。

基因治療能夠挽救或維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能，有望通過(guò)保留和提高患者視力進(jìn)而改善其生活質(zhì)量。正在進(jìn)行的已注冊(cè)臨床研究中針對(duì)視網(wǎng)膜疾病基因治療的有76項(xiàng)，其中43項(xiàng)正處于研究階段或已在招募患者，19項(xiàng)已經(jīng)完成，3項(xiàng)正處于注冊(cè)階段。43項(xiàng)正在進(jìn)行的項(xiàng)目中有3項(xiàng)獲得了部分安全性和有效性等結(jié)果，并已公開(kāi)發(fā)表?，F(xiàn)階段進(jìn)行干預(yù)的研究占比75%，其余多為對(duì)已干預(yù)患者的長(zhǎng)期隨訪研究，研究范圍主要覆蓋10種視網(wǎng)膜相關(guān)的疾病(表1)，臨床一期研究占到全部的一半左右，其余則處于2期或3期階段。在這些研究中，有37項(xiàng)受試者包含兒童，其中2項(xiàng)僅針對(duì)兒童進(jìn)行。雖然已有研究表明基因治療中使用載體可能具有包括炎癥、全身反應(yīng)等潛在危害，但病毒載體尤其是腺相關(guān)病毒載體仍是目前基因治療的主要工具。和其他疾病一樣，視網(wǎng)膜疾病的基因治療也主要是通過(guò)病毒載體將正?；?、cDNA或其他生物制劑導(dǎo)入視網(wǎng)膜下或玻璃體腔等部位。

2 常見(jiàn)視網(wǎng)膜疾病的基因治療研究現(xiàn)狀

眼所處的位置和解剖學(xué)特點(diǎn)使之在基因治療研究領(lǐng)域優(yōu)于深部器官，研究者易于操作并能夠?qū)ρ鄄堪Y狀和療效獲得直觀評(píng)價(jià)，并能避免各種原因?qū)ζ渌M織器官產(chǎn)生的影響。除此之外，由于視網(wǎng)膜下間隙是免疫赦免部位[2]，視網(wǎng)膜及其周?chē)h(huán)境對(duì)免疫反應(yīng)的局部抑制使外周強(qiáng)制表達(dá)視網(wǎng)膜抗原性時(shí)發(fā)生免疫抑制和抗自身免疫[3]，使免疫反應(yīng)減弱或不發(fā)生。加之成熟可靠的操作技術(shù)、多樣化的檢查手段，使眼成為基因治療研究的理想器官。這里我們選取幾種前景良好的視網(wǎng)膜疾病進(jìn)行討論，基因治療將為這些疾病的患者帶來(lái)新希望。

2.1 Leber先天性黑矇(Leber’s congenital amaurosis，LCA) 2017年Spark Therapeutics公司制造的針對(duì)RPE65突變相關(guān)LCA的產(chǎn)品Luxturna獲得FDA批準(zhǔn)，成為第1批基因治療生物制劑，標(biāo)志著基因治療時(shí)代的到來(lái)[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)至少存在25個(gè)基因突變位點(diǎn)可能造成LCA[5]，臨床最常見(jiàn)的類(lèi)型為編碼RPE65視黃醛視覺(jué)循環(huán)關(guān)鍵酶的基因發(fā)生突變，兩組同期臨床實(shí)驗(yàn)研究表明在視網(wǎng)膜下注射攜帶RPE65互補(bǔ)DNA的重組腺相關(guān)病毒，受試者的視敏感度、光敏感度、色覺(jué)、光譜敏感度等指標(biāo)至少在3年內(nèi)得到顯著改善，并在1年時(shí)達(dá)到高峰。治療效果與維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)，而與年齡無(wú)關(guān)[6-8]。平行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明了不同物種間的差異性，人類(lèi)基因治療還無(wú)法維持長(zhǎng)期穩(wěn)定的狀態(tài)[7]。在1項(xiàng)1期隨訪試驗(yàn)中，通過(guò)多種測(cè)量手段敘述了該項(xiàng)基因增強(qiáng)療法的綜合效益，研究雙側(cè)和對(duì)側(cè)眼基因治療的效果，首次確定了對(duì)側(cè)眼重復(fù)治療的效果和安全性[9]。另外，有研究[10-11]通過(guò)fMRI監(jiān)測(cè)證明受試者在基因治療后由于視網(wǎng)膜功能的恢復(fù)，傳入信息引起視皮質(zhì)的響應(yīng)和激活在最多3年內(nèi)維持改善，并作為獨(dú)立評(píng)估基因治療效果和持久性的補(bǔ)充方法。3期臨床試驗(yàn)?zāi)壳耙勋@批的生物藥品 Luxturna用于治療RPE65相關(guān)的LCA，患者需每年行雙側(cè)視網(wǎng)膜下注射治療[12]。

表1 已注冊(cè)的視網(wǎng)膜疾病基因治療

CEP290相關(guān)LCA是兒童失明常見(jiàn)的遺傳類(lèi)型，這種剪接突變經(jīng)反寡義核苷酸(antisense oligonucleotides，AONs)的治療能得到非常顯著的效果，通過(guò)直接或以病毒載體的方式都能使其轉(zhuǎn)錄被糾正[13]。在常見(jiàn)的CEP290突變[14]中使用剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸繞過(guò)突變隱蔽外顯子，使異常成纖維細(xì)胞恢復(fù)其纖毛，證明其異常剪接位點(diǎn)可以被糾正[14]。通過(guò)斷裂內(nèi)含肽治療鼠模型，成功通過(guò)反式剪接合成完整的CEP290蛋白，能得到顯著效果[15]。超過(guò)88%的GUCY2D突變會(huì)導(dǎo)致特殊的LCA，其編碼的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶是光轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵酶，功能障礙時(shí)主要損傷視錐細(xì)胞，視桿細(xì)胞得以保留[16]。將人GUCY2D用于治療鼠模型，6個(gè)月內(nèi)保存視錐細(xì)胞效果良好，有望用于基因治療的臨床研究[17]。另一種早發(fā)型LCA致病基因LCA5的突變導(dǎo)致Lebercilin蛋白功能障礙，嚴(yán)重影響光感受器外段運(yùn)輸。將人LCA5 cDNA注射到LCA5無(wú)效小鼠模型中進(jìn)行基因增強(qiáng)治療，至少能夠部分挽救視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和視功能[18]。CRB1相關(guān)的LCA目前缺乏有效治療，研究仍處在臨床治療前期[19]。

2.2 視網(wǎng)膜色素變性(Retinitis pigmentosa, RP) RP是光感受器變性引起視黃酸受體(retinoic acid receptor, RAR)水平增高的致盲性疾病，因此有研究者[20]通過(guò)增強(qiáng)RAR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方式建立小鼠模型，并以基因治療方式阻斷視黃酸信號(hào)通路，從而挽救RP。編碼環(huán)核苷酸門(mén)控通道β 1(cyclic nucleotide-gated channel β 1, CNGB1)的基因突變導(dǎo)致常染色體隱性RP, CNGB1-X26小鼠和CNGB1 -/-犬模型與人類(lèi)RP45有相似的表型[21]，研究者[22]分別通過(guò)構(gòu)建鼠視紫紅質(zhì)啟動(dòng)子調(diào)控CNGB1α的基因治療和人G蛋白偶聯(lián)受體激酶1啟動(dòng)子調(diào)控cCNGB1對(duì)2種模型進(jìn)行基因增強(qiáng)治療，并通過(guò)晚期視網(wǎng)膜成像等測(cè)量方法證明了其效果[23]。另一種方式是借助基因編輯技術(shù)，在Rho -/-，Rd10和RHO-P347S 3種鼠模型上以CRISPR/Cas9靶向破壞有絲分裂后期視桿細(xì)胞的Nrl基因，通過(guò)延長(zhǎng)正常甚至是功能障礙或形態(tài)異常視桿細(xì)胞的存活時(shí)間，間接提高視紫紅質(zhì)基因突變RP的視錐細(xì)胞存活能力[24]。與之類(lèi)似的是滅活Nrl基因下游與之起到協(xié)同作用的轉(zhuǎn)錄因子Nr2e3，同樣能使視桿細(xì)胞獲得部分視錐細(xì)胞的特性，研究者[25]在Rd10和FVB/N 2種不同RP模型上進(jìn)行了AAV-gRNA/Cas9治療，結(jié)果顯示該基因組編輯方法能有效地將視桿細(xì)胞重編程為視錐細(xì)胞，進(jìn)而有效保留光感受器，對(duì)于以視桿細(xì)胞丟失繼發(fā)視錐細(xì)胞喪失為特點(diǎn)的RP而言，這種治療方式具有良好的前景。同源獨(dú)立的靶向整合是基于CRISPR-Cas技術(shù)的一項(xiàng)新方法，大鼠模型證明了視網(wǎng)膜下注射對(duì)RP的治療作用[26]，這對(duì)基礎(chǔ)技術(shù)研究和基因治療都作出了貢獻(xiàn)。由于RP致病基因的異質(zhì)性通常使基因治療受到限制，而非特異性的基因治療能對(duì)挽救不同亞型的RP作出貢獻(xiàn)，靶向抑制Sirt6能將視桿細(xì)胞重編程，以增強(qiáng)其糖酵解來(lái)延緩RP發(fā)展[27]，將基因治療用于代謝和抗氧化途徑能普遍緩解神經(jīng)退行性疾病帶來(lái)的危害。目前RP還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但已有部分臨床試驗(yàn)正在開(kāi)展。

2.3 X-連鎖視網(wǎng)膜劈裂(X-linked retinoschisis, XLRS) XLRS是由視網(wǎng)膜各層質(zhì)膜蛋白結(jié)合相關(guān)的視網(wǎng)膜劈裂[28]基因突變導(dǎo)致的疾病。RS1-KO鼠模型已證明基因增強(qiáng)治療對(duì)光感受器喪失、視網(wǎng)膜損傷和囊腫形成都有積極作用，突觸的結(jié)構(gòu)和功能都得到了顯著恢復(fù)[29]。但在一項(xiàng)前瞻性臨床研究[30]中，9名受試者接受了單次單側(cè)玻璃體腔內(nèi)治療，病毒載體的免疫原性隨劑量升高，其安全性和耐受性不理想。近期有研究者[31]建立了轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶攜帶致病突變(RS1，p.Y65X)的小鼠模型RS1-KI，以期對(duì)個(gè)體化基因組編輯治療提供幫助。另有以固體脂質(zhì)納米顆粒結(jié)合右旋糖苷或透明質(zhì)酸構(gòu)建載體，有效通過(guò)承載鼠視蛋白驅(qū)動(dòng)子mPOS控制人RS1基因?qū)κ竽Ｐ瓦M(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)有助于鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改善[32]。

2.4 色盲 色盲主要由視錐細(xì)胞編碼環(huán)核苷酸門(mén)控[33]離子通道亞基A3(α亞基)或B3(β亞基)的基因突變導(dǎo)致，其他罕見(jiàn)病因包括GNAT2，PDE6C和PDE6H突變。在CNGA3(-/-)/Nrl(-/-)的鼠模型研究中，證明基因治療能有效改善視錐細(xì)胞功能，同時(shí)由于病變主要發(fā)生在黃斑中心凹，玻璃體注射還避免了潛在的視網(wǎng)膜損傷[34]，提示玻璃體內(nèi)注射的方式有望應(yīng)用于人類(lèi)黃斑中心凹疾病的安全基因治療。但另一項(xiàng)基因增強(qiáng)治療研究中，將紅/綠視蛋白啟動(dòng)子用于控制CNGA3基因，經(jīng)視網(wǎng)膜下注射治療綿羊，其效果已維持3年以上且沒(méi)有明顯副作用[35]。多個(gè)機(jī)構(gòu)從2015年起開(kāi)始招募受試者進(jìn)行CNGA3或CNGB3 1期試驗(yàn)，目前這2種主要突變都在臨床研究過(guò)程中[36]。另外，有研究者[37]發(fā)現(xiàn)視錐細(xì)胞PDE6α'對(duì)其配體PDE6γ'的親和力高于對(duì)視桿細(xì)胞PDE6γ的親和力，PDE6γ'還有利于組裝并形成穩(wěn)定的PDE6全酶，這在研究PDE6α'相關(guān)色盲的基因治療時(shí)有重要意義。

2.5 Stargardt病(Stargardt disease, STGD) 最主要的STGD為隱性Stargardt黃斑變性(STGD1)，是由編碼ATP結(jié)合盒亞家族A成員4(ATP binding cassette subfamily A member 4 , ABCA4)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因突變引起。目前STGD還不具備標(biāo)準(zhǔn)的臨床治療方法，相關(guān)研究人員在1年時(shí)間內(nèi)對(duì)27名受試者進(jìn)行了3次視網(wǎng)膜下治療，并計(jì)劃隨訪15年以評(píng)估其長(zhǎng)期安全性和療效[37]。為提高STGD治療的有效性，各種研究機(jī)構(gòu)正在開(kāi)展相關(guān)的臨床前實(shí)驗(yàn)，以求得到更好的治療方案。有研究者[38]嘗試通過(guò)基因治療來(lái)增加小鼠中最重要的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白CRRY從而挽救STGD1，基因治療對(duì)疾病導(dǎo)致的脂褐素累積和光感受器變性有效，并對(duì)同類(lèi)病因引起的視網(wǎng)膜疾病有提示作用。為建立更良好的疾病模型，對(duì)ABCA4基因進(jìn)行移碼插入(c.4176insC)，可獲得純合ABC4蛋白功能喪失的犬，或有助于建立STGD1的大型動(dòng)物模型[39]。除此之外，針對(duì)ABC4大基因優(yōu)化的雙AAV雜合ABCA4載體，能有效增加基因?qū)氲挠行訹40]。最新對(duì)于大基因的研究通過(guò)遺傳元件斷裂內(nèi)含肽將多個(gè)AAV載體運(yùn)送的多肽片段拼接為完整的蛋白，進(jìn)而在鼠模型上實(shí)現(xiàn)STGD1的高效治療[15]。

3 基因治療的前景和局限

長(zhǎng)期以來(lái)遺傳性視網(wǎng)膜疾病通過(guò)傳統(tǒng)藥物和手術(shù)治療無(wú)法取得顯著效果，且存在難治愈、治療手段少、預(yù)后差等問(wèn)題。新興的基因治療將重點(diǎn)放在糾正或替代致病基因帶來(lái)的異常改變上，通過(guò)載體穩(wěn)定導(dǎo)入足量治療基因或通過(guò)基因組編輯技術(shù)進(jìn)行基因置換、基因沉默、基因增強(qiáng)、基因修復(fù)等方式來(lái)減輕突變基因的危害，有效、安全、經(jīng)濟(jì)地整合遺傳信息，延長(zhǎng)視網(wǎng)膜受累細(xì)胞壽命，維持視力[36]。人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成和基因測(cè)序技術(shù)的成熟，為基因治療大范圍用于治療視網(wǎng)膜相關(guān)疾病提供了樂(lè)觀前景。

然而，目前基因治療仍存在許多挑戰(zhàn)，臨床前階段向臨床成果轉(zhuǎn)化緩慢，侵入性治療對(duì)視網(wǎng)膜的損傷和相關(guān)并發(fā)癥，長(zhǎng)期治療的耐受性和效果維持，治療費(fèi)用昂貴，能否為治療其他遺傳性疾病帶來(lái)幫助等問(wèn)題還需要進(jìn)一步解決。

基因治療尚處在起步階段，隨著更加深入的研究和發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多疾病將通過(guò)這一極富前景的方法得到解決。