李孝全 莫靜欣

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院急危重癥中心，十堰 442000)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一種易并發(fā)多器官衰竭綜合征的炎性疾病，是由胰酶對胰腺自我消化引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)及全身各器官炎癥損傷反應(yīng)[1]。SAP引起的腎衰竭和肺損傷在臨床上非常常見，嚴(yán)重時引起急性心肌炎，死亡率極高[2]。中藥在中國有幾千年的應(yīng)用歷史，其中最早與胰腺炎治療相關(guān)的中藥是大黃[3]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載，大黃為寥科植物，以干燥的根或根莖入藥，其味苦寒，具下淤血、推陳致新、調(diào)中化食等功效[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，大黃具抗菌、抗炎、保肝利膽、改善腎功能等作用[5]。大量研究報道大黃具有治療SAP作用，但作用機制尚未明確[6]。本研究通過觀察大黃對SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡、炎癥因子分泌及JAK2/STAT3信號通路的影響，揭示大黃治療SAP的機制與JAK2/STAT3信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級SD大鼠60只,體質(zhì)量180～220 g，購自上海凱學(xué)生物公司；大黃免煎顆粒購自河北第二醫(yī)院中藥房；TNF-α檢測試劑盒、人NO ELISA檢測試劑盒購自碧云天；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；胰蛋白酶購自美國Sellect公司；SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；PVDF膜購自Roche公司；大鼠肺泡巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒購自無錫欣潤生物；兔抗鼠p-JAK2多克隆抗體、兔抗鼠p-STAT2多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自上海信裕生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1SAP大鼠模型的建立及分組大黃溶液的制備 大黃免煎顆粒用無菌生理鹽水配制成1 g/L的大黃溶液。將60只清潔級SD大鼠隨機分成3組：假手術(shù)組(Sham組)、SAP組、大黃組(Rhubarb組)，每組20只。參照呂冠華等[7]的方法對大鼠行開腹手術(shù)，5%?；悄懰徕c (1 ml/kg)經(jīng)十二指腸緩慢注入膽管，建立大鼠SAP模型，標(biāo)記為SAP組。Sham組：將20只大鼠開腹后翻動十二指腸，然后關(guān)閉腹部。Sham組和SAP組大鼠術(shù)后3 h給予生理鹽水灌胃(1 ml/200 g)，2次/d，間隔12 h。Rhubarb組大鼠術(shù)后3 h給予等劑量1 g/L大黃溶液灌胃，2次/d，間隔12 h。72 h后處死大鼠，摘取左肺，分離肺泡巨噬細(xì)胞。按照大鼠肺泡巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒說明書分離巨噬細(xì)胞，用組織處理緩沖液、組織解離緩沖液、組織解離液、大鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)緩沖液、大鼠巨噬細(xì)胞完全培養(yǎng)液分離、培養(yǎng)并純化大鼠巨噬細(xì)胞。

1.2.2ELISA實驗 收集各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，按照TNF-α檢測試劑盒說明書和人NO ELISA檢測試劑盒說明書檢測大鼠肺泡巨噬細(xì)胞上清中TNF-α及NO含量。

1.2.3大鼠肺病理性形態(tài)觀察 按照文秀華等[8]的實驗方法進行大鼠肺組織病理切片的制作和評分。

1.2.4大鼠肺濕/干重比率測定 稱量各組大鼠左肺重量，記為肺濕重，置于80℃烘箱烘烤約20 h至恒重，取出稱重，記為肺干重。肺濕/干重比率=肺濕重/肺干重 × 100%。

1.2.5SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡測定 收集各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，按照Annexin V FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書要求操作，加入Annexin V-FITC和PI，流式細(xì)胞儀測定結(jié)果。細(xì)胞凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復(fù)3次。

1.2.6SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α、iNOS mRNA檢測 收集各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，試劑盒提取RNA，定量后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR檢測TNF-α、iNOS mRNA，2-ΔΔCt計算TNF-α、iNOS表達。TNF-α引物，F(xiàn)：5′-ATGAGCACTGAAAGCATGATCCG-3′，R：5′-TCACAGGGCAATGATCCCAAA-3′；iNOS引物,F：5′-TGCCTGTATGCTGATGCG-3′，R：5′-GGATGTCGGACTTTGTAGATT-3′；GAPDH引物，F(xiàn)：5′-TCCCTC-AAGATTGCTAGCAA-3′，R：5′-AGATCCACAACGG-ATACATT-3′。PCR條件為：94℃變性2 min；94℃ 30 min，58℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)45次；72℃延伸2 min。

1.2.7SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表達測定 收集各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min。取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5 %脫脂奶粉封閉2 h，洗膜，加入一抗(兔抗鼠p-JAK2多克隆抗體、兔抗鼠p-STAT3多克隆抗體)，4℃過夜孵育，洗膜，加二抗(HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體)，4℃孵育 2 h。加發(fā)光液曝光。

2 結(jié)果

2.1胰腺組織病理性形態(tài)學(xué)觀察 與Sham組相比，SAP組大鼠胰腺組織病例評分顯著升高(P<0.05，圖1)。

2.2SAP組大鼠血清淀粉酶水平變化 與Sham組相比，SAP組大鼠血清中血清淀粉酶含量顯著升高，與SAP組相比，Rhubarb組大鼠血清中血清淀粉酶含量顯著降低(P<0.05，圖2)。

2.3SAP組大鼠肺濕/干重比率變化 與Sham組相比，SAP組大鼠肺濕/干重比率顯著升高，與SAP組相比，Rhubarb組大鼠肺濕/干重比率顯著降低(P<0.05，圖3)。

2.4大黃對SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡影響 與Sham組相比，SAP組大鼠巨噬細(xì)胞凋亡率顯著降低，與SAP組相比，Rhubarb組大鼠巨噬細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05,圖4)。

圖1 胰腺組織病理性形態(tài)學(xué)觀察(×200)Fig.1 Pathological morphological observation of pancreas(×200)Note:A.Histopathological examination of pancreas;B.Histopathological score of pancreas.Compared with Sham group,*.P<0.05.

圖2 SAP組大鼠血清淀粉酶水平變化Fig.2 Changes in serum amylase levels in rats of SAP groupNote:Compared with Sham group,*.P<0.05;compared with SAP group,#.P<0.05.

圖3 SAP組大鼠肺濕/干重比率變化Fig.3 Changes in lung wet/dry weight ratio in rats of SAP groupNote:Compared with Sham group,*.P<0.05;compared with SAP group,#.P<0.05.

圖4 大黃對SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of rhubarb on apoptosis of alveolar macrophages in SAP ratsNote:Compared with Sham group,*.P<0.05;compared with SAP group,#.P<0.05.

2.5大黃對SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α、NO水平影響 與Sham組相比，SAP組大鼠巨噬細(xì)胞TNF-α、NO含量均顯著升高，與SAP組相比，Rhubarb組大鼠巨噬細(xì)胞TNF-α、NO含量均顯著降低(P<0.05,圖5)。

圖5 大黃對SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α、NO水平的影響Fig.5 Effect of rhubarb on levels of TNF-α and NO in alveolar macrophages of SAP ratsNote:Compared with Sham group,*.P<0.05;compared with SAP group,#.P<0.05.

圖6 大黃對SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α、iNOS mRNA表達的影響Fig.6 Effect of rhubarb on expression of TNF-α and iNOS mRNA in alveolar macrophages of SAP ratsNote:Compared with Sham group,*.P<0.05;compared with SAP group,#.P<0.05.

圖7 大黃對SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路的影響Fig.7 Effect of rhubarb on JAK2/STAT3 signaling pathway in alveolar macrophages of SAP ratsNote:Compared with Sham group,*.P<0.05;compared with SAP group,#.P<0.05.

2.6大黃對SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α、iNOS mRNA表達影響 與Sham組相比，SAP組大鼠巨噬細(xì)胞TNF-α、iNOS mRNA相對表達量均顯著升高，與SAP組相比，Rhubarb組大鼠巨噬細(xì)胞TNF-α、iNOS mRNA相對表達量均顯著降低(P<0.05，圖6)。

2.7大黃對SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路影響 與Sham組相比，SAP組大鼠巨噬細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達均顯著升高，與SAP組相比，Rhubarb組大鼠巨噬細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達均顯著降低(P<0.05，圖7)。

3 討論

大量研究報道，大黃具有治療胰腺炎功能，但其作用機制尚未明確[9，10]。Zhao等[6]在大鼠SAP肺損傷的研究中報道，大黃可抑制大鼠SAP淀粉酶水平和炎癥因子分泌，揭示大黃在SAP中的保護功能。楊寶晶等[11]報道，大黃素通過下調(diào)SAP大鼠肺損傷中TNF-α、IL-6水平，上調(diào)IL-10、Treg、Foxp3水平減輕SAP肺損傷。Zhou等[12]在SAP患者的研究中發(fā)現(xiàn)，粗大黃可作為生長抑制素顯著抑制并發(fā)癥的產(chǎn)生，減輕胰腺炎患者痛苦。本研究建立牛黃膽酸鈉誘導(dǎo)的SAP大鼠模型，通過病理組織學(xué)觀察、肺干濕重比和淀粉酶含量測定驗證模型的成功構(gòu)建，為研究大黃對SAP大鼠模型的藥物治療奠定基礎(chǔ)。

凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定進行的自主有序死亡的過程，與人類機體許多疾病密切相關(guān)。He等[13]報道，胰腺炎細(xì)胞的凋亡周期延長，提示細(xì)胞凋亡異常降低與SAP病理進程有關(guān)。本研究檢測了大黃治療的SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)大黃治療后細(xì)胞凋亡率顯著升高，與He等的研究結(jié)果一致，表明大黃可逆轉(zhuǎn)胰腺炎大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡抑制功能。

炎癥細(xì)胞因子是內(nèi)源性多肽類細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)細(xì)胞生成的總稱，包括白細(xì)胞介素、干擾素、生長因子、細(xì)胞刺激因子、腫瘤壞死因子等。細(xì)胞因子主要由外周免疫細(xì)胞合成(如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、纖維母細(xì)胞)，但許多其他類型的細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)也可產(chǎn)生細(xì)胞因子[14]。炎癥因子為細(xì)胞因子的一部分，促炎因子包括瘤壞死因子、IL-6和IL-1家族細(xì)胞因子等[15]。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠模型中血清淀粉酶AMY和TNF-α水平均明顯升高，大黃治療可顯著降低AMY和TNF-α水平，并減緩胰腺和其他組織的病理變化。本研究通過ELISA檢測了大黃治療的SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中TNF-α、NO含量，發(fā)現(xiàn)TNF-α、NO含量均顯著降低；qRT-PCR結(jié)果表明，大鼠巨噬細(xì)胞中TNF-α、iNOS mRNA表達明顯降低，提示大黃具有抑制SAP大鼠炎癥水平作用，為大黃在胰腺炎治療的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

Janus家族酪氨酸激酶Jaks和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子STAT蛋白是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵，積極參與細(xì)胞的存活、增殖、分化和凋亡[17]。Jaks與許多細(xì)胞因子和生長因子受體有組成性相關(guān)，活化的Jaks最終誘導(dǎo)STAT磷酸化，調(diào)節(jié)靶基因表達[18]。吳麗等[19]研究發(fā)現(xiàn)，大黃附子能抑制SAP小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中JAK2和STAT3表達水平和炎癥因子TNF-α及IL-6含量。本研究通過Western blot檢測大黃治療的SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表達發(fā)現(xiàn)，大黃可下調(diào)p-JAK2、p-STAT3蛋白表達，提示大黃可使JAK2/STAT3信號通路失活，說明大黃在SAP中發(fā)揮治療作用的機制與抑制炎癥因子分泌和JAK2/STAT3信號通路失活密切相關(guān)。

綜上所述，中藥大黃可促進SAP大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡，其機制可能與抑制炎癥因子分泌及失活JAK2/STAT3信號通路有關(guān)。