羅安玉 劉瀚霖 謝小飛 黃 琛

(武漢科技大學附屬漢陽醫(yī)院骨二科，武漢 430050)

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是臨床常見的關節(jié)軟骨退行性疾病，表現(xiàn)為軟骨下骨硬化，滑膜炎，骨贅形成和疼痛[1]。在中國OA的患病率高達18%，且女性患者患病率高于男性，同時骨關節(jié)炎已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的第四大致殘性疾病[2]。OA的發(fā)病機制尚不清楚，目前的研究普遍認為年齡、性別、肥胖、關節(jié)生物力學改變以及個體的遺傳特點是OA發(fā)病的潛在危險因素[2]。在OA的發(fā)病過程中，關節(jié)軟骨退行性變是其主要表現(xiàn)和關鍵環(huán)節(jié)[3]。越來越多的研究證據(jù)表明：OA是一種代謝紊亂性疾病，關節(jié)軟骨細胞的代謝差異可以在一定程度上反映軟骨細胞的健康或疾病狀態(tài)，在健康的關節(jié)軟骨中，細胞外基質(zhì)的代謝率相對較低，關節(jié)軟骨細胞能夠維持自身穩(wěn)態(tài)[4]。在OA的病情進展過程中，肥大增生的相關基因表達上調(diào)，伴隨著分解代謝的增強和細胞外基質(zhì)的降解，關節(jié)軟骨細胞呈現(xiàn)肥大樣表型[5]。既往研究認為TGF-β信號是維持關節(jié)軟骨細胞穩(wěn)態(tài)的關鍵因子，抑制TGF-β及相關分子會導致軟骨細胞肥大引起小鼠自發(fā)性OA[6]。而BMP信號通路的激活可以誘導關節(jié)軟骨細胞發(fā)生肥大增生，形成骨贅，并出現(xiàn)骨關節(jié)炎性病變[7]。目前已有大量研究表明TGF-β和BMP信號通路對關節(jié)軟骨細胞分化具有重要調(diào)控作用，然而TGF-β和BMP在關節(jié)炎背景下的異常表達對細胞代謝發(fā)揮差異性調(diào)節(jié)機制并不清楚。因此本項研究從OA患者的軟骨組織中分離出人源性原代關節(jié)軟骨細胞，分別在體外給予TGF-β1和BMP2處理后觀察細胞代謝狀態(tài)的差異，深入分析TGF-β1和BMP2信號通路對關節(jié)軟骨細胞代謝的調(diào)控作用和骨關節(jié)炎的致病分子機制，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料及試劑 DMEM培養(yǎng)基 (美國Thermo公司，貨號31053028)；Ⅱ型膠原酶 (美國Roche公司，貨號11213865001)；胎牛血清(美國Gibco公司，貨號10082147)；二甲基亞砜(美國Sigma公司，貨號D2650)；BCA蛋白定量試劑盒(中國聯(lián)科生物公司，貨號A81911125)；PVDF膜(美國Millipore公司，0.45 μm，貨號R8HA7852)；Glut1單克隆抗體(美國CST公司，貨號1239S)，己糖激酶Ⅰ(HKⅠ)單克隆抗體(美國CST公司，貨號2024T)，己糖激酶Ⅱ(HKⅡ)(美國CST公司，貨號2867T)，LDHA(美國CST公司，貨號2012)，β-actin單克隆抗體(美國Abcam公司，貨號ab8245)；BMP2 (美國R&D 公司，貨號355-BM-010)；TGF-β1(美國R&D 公司，貨號240-B-002/CF)；葡萄糖檢測試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司，貨號Gahk-20);L-乳酸檢測試劑盒(美國Biosciences公司，貨號120001100A);CellTiter-Glo 2.0試劑盒(美國Promega公司，貨號G9242)。

1.1.2實驗儀器 倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；5%CO2孵育箱(美國Thermo Fisher公司)；微量孔板分光光度計(美國BioTek公司)；低溫離心機(德國R&D公司)。

1.2方法

1.2.1人體軟骨組織的獲取 收集2017年1月至2019年1月在我院骨科進行全膝關節(jié)置換的40例OA患者的廢棄關節(jié)軟骨組織標本，取材位置為股骨髁內(nèi)側關節(jié)軟骨。原發(fā)性骨關節(jié)炎的診斷標準參照美國風濕病學會膝骨關節(jié)炎診斷標準[8，9]。本研究獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準(批準號:S2017-21-1)，操作前征得所有患者知情同意，并簽署知情同意書。

1.2.2人關節(jié)軟骨細胞的分離培養(yǎng) 獲取OA患者股骨髁內(nèi)側的關節(jié)軟骨用于軟骨細胞的分離培養(yǎng)。使用一次性手術刀將關節(jié)軟骨附近的殘留結締組織以及骨組織從底層軟骨刮除，并放置在1×PBS中反復沖洗。無菌眼科剪將軟骨組織剪碎成2 mm碎片，1×PBS洗滌3遍，隨后放置在無菌培養(yǎng)瓶中，加入10倍體積含0.2%Ⅱ型膠原酶的DMEM培養(yǎng)基與2倍體積的HBSS緩沖液，37℃下振蕩消化16 h。充分消化后，以70 mm濾器過濾軟骨細胞，1 200 r/min 離心5 min棄上清，并用1×PBS洗滌2次。加入含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，最后以培養(yǎng)基吹打混勻細胞沉淀后接種入培養(yǎng)瓶中，置于37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每48 h更換培養(yǎng)液1次。實驗過程中以1×104個/cm2細胞接種在不同的孔板中，生長24～28 h 后，更換培養(yǎng)基再分別采用BMP2(100 ng/ml)或TGF-β1(5 ng/ml)處理軟骨細胞48～72 h進行后續(xù)檢測。

1.2.3代謝特征的測定和分析 BMP2和TGF-β1處理關節(jié)軟骨細胞后對細胞培養(yǎng)上清中的葡萄糖攝取量、乳酸和ATP產(chǎn)量進行定量分析。采用葡萄糖檢測試劑盒測定細胞外葡萄糖濃度。采用L-乳酸檢測試劑盒測定細胞培養(yǎng)上清中的乳酸含量。采用CellTiter-Glo 2.0試劑盒檢測細胞內(nèi)ATP水平。

1.2.4Seahors XF細胞線粒體壓力試驗評估線粒體耗氧情況 將關節(jié)軟骨細胞以每孔40 000個細胞的密度接種至Seahors XF96細胞培養(yǎng)板上，給予BMP2和TGF-β1處理后，將細胞培養(yǎng)基更換為添加了5.5 mmol/L葡萄糖和2 mmol/L Glutamax的檢測液，并在無CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h。開始運行實驗程序，將加過刺激的測試板和裝有標準液的校準板放置于儀器托板上，連續(xù)測量Seahors XF96細胞培養(yǎng)板中的OCR值，完成測量后在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。

1.2.5Western blot檢測目的蛋白表達水平 使用添加磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取關節(jié)軟骨細胞中的總蛋白，Western blot法檢測細胞中Glut1、HKⅠ、HKⅡ、LDHA及Actin的蛋白表達量。具體步驟如下：獲得細胞蛋白上清后以BCA法測定總蛋白濃度，95℃變性5 min，使用SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，每組蛋白上樣15 μg/孔，隨后將目的蛋白以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%BSA-TBS溶液封閉1 h；5%BSA-TBST稀釋一抗，置于4℃水平搖床孵育過夜；次日，使用TBST洗膜3次，每次10 min；5%BSA-TBST稀釋二抗，室溫孵育40 min；TBST洗膜3次，每次10 min；ECL滴加到膜的蛋白面，反應1～5 min后曝光顯影。Image-Pro Plus 6.0軟件掃描測定目的條帶的灰度值。

2 結果

2.1TGF-β1與BMP2對骨關節(jié)炎患者的原代關節(jié)軟骨細胞糖酵解代謝呈現(xiàn)相反作用效果 相比于對照組，TGF-β1的刺激會顯著增加細胞的葡萄糖攝取(葡萄糖攝取量增加48.1%，P<0.001)和乳酸的產(chǎn)生(乳酸產(chǎn)量增加19.3%，P<0.001)。相反，BMP2的刺激會輕度抑制細胞的葡萄糖攝取(細胞葡萄糖攝取減少5.2%，P=0.48)和乳酸的產(chǎn)生(乳酸產(chǎn)量減少2.8%，P=0.34)。此外，在TGF-β1處理后的軟骨細胞中可以觀察到ATP明顯減少(ATP產(chǎn)量減少了12.4%，P<0.001)；而BMP2處理后的細胞ATP顯著增加(ATP的產(chǎn)量增加了14.0%，P<0.001)。見圖1。

2.2TGF-β1誘導骨關節(jié)炎患者的關節(jié)軟骨細胞發(fā)生有氧糖酵解代謝 在TGF-β1刺激后，細胞中的Glut1和HKⅡ蛋白表達增加了約1倍。與此同時，另一種己糖激酶亞型HKⅠ在TGF-β1誘導的細胞中的表達量也有所增加。相反，BMP2的刺激對HKⅡ的表達幾乎沒有影響，但導致Glut1水平上調(diào)約20%，并促進HKⅠ的表達上調(diào)約50%。TGF-β1和BMP2的刺激均不會對LDHA產(chǎn)生影響，見圖2。

2.3BMP2促進骨關節(jié)炎患者的關節(jié)軟骨細胞發(fā)生氧化磷酸化代謝 如圖3所示，對照組、TGF-β1

和BMP2處理組的平均線粒體基礎耗氧量分別為47.3 pmoles/min、53.2 pmoles/min和87.8 pmoles/min，最大耗氧量為73.6 pmoles/min、77.9 pmoles/min和160.2 pmoles/min。與對照組相比，BMP2處理后的線粒體耗氧量明顯升高，線粒體的基礎耗氧量和最大耗氧量均增加約1倍。相比之下，TGF-β1處理后的細胞基礎耗氧率和最大耗氧率與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 OA患者關節(jié)軟骨細胞的葡萄糖攝取量、乳酸和ATP產(chǎn)量Fig.1 Glucose uptake, lactic acid and ATP production in articular chondrocytes from OA patients

圖3 OA患者來源的關節(jié)軟骨細胞的線粒體耗氧量分析Fig.3 Mitochondrial oxygen consumption of chondrocytes from OA patientsNote: Compared with control，*.P<0.05.

圖2 關節(jié)軟骨細胞中Glut1，HKⅠ，HKⅡ，LDHA的蛋白表達水平及相對半定量分析Fig.2 Protein expression level and relative semi-quantitative analysis of Glut1,HKⅠ,HKⅡ,LDHA in articular chondrocytesNote: Compared with control，*.P<0.05.

3 討論

本文通過對OA患者來源的關節(jié)軟骨細胞進行TGF-β和BMP2的體外刺激實驗，深入挖掘了TGF-β和BMP兩條信號通路對關節(jié)軟骨細胞糖代謝過程的調(diào)控作用及分子機制，發(fā)現(xiàn)TGF-β和BMP2可以誘導OA患者關節(jié)軟骨細胞進行不同的能量代謝途徑。具體而言，TGF-β1通過上調(diào)糖酵解的關鍵蛋白Glut1和HKⅡ，刺激關節(jié)軟骨細胞進行糖酵解代謝，導致乳酸的分泌和葡萄糖的攝取均增加，同時不會影響細胞的氧化磷酸化過程。而BMP2可以明顯促進線粒體氧化磷酸化代謝，對葡萄糖的攝取和糖酵解關鍵蛋白的表達無明顯影響。

TGF-β信號通過抑制軟骨細胞的肥大分化維持軟骨細胞的穩(wěn)態(tài)和關節(jié)軟骨的完整性，一旦TGF-β信號通路被抑制，關節(jié)軟骨就會出現(xiàn)骨關節(jié)炎的病理改變[12]。而異常升高的BMP信號也會破壞關節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)，促進OA病情進展[13]。在正常狀態(tài)下TGF-β/BMP信號通路處于動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦這種平衡向分解代謝和BMP的方向傾斜，就會導致關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)的丟失和骨關節(jié)炎的發(fā)生，這已經(jīng)被證實是小鼠和人類OA發(fā)生發(fā)展的重要原因[14]。然而，TGF-β/BMP信號調(diào)節(jié)細胞分化和代謝的具體機制仍有待進一步探索。細胞能量代謝對于維持軟骨的分化穩(wěn)態(tài)至關重要，并且會在OA的致病過程中發(fā)生改變。正常狀態(tài)下，軟骨中含有高濃度乳酸和糖酵解代謝的各種酶，含氧低,軟骨細胞傾向于進行糖酵解提供能量保證細胞內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定。一旦軟骨細胞氧化磷酸化代謝增加就提示分解代謝途徑的失衡和骨關節(jié)炎的發(fā)展[15]。本研究發(fā)現(xiàn)：常氧條件下，外源性給予TGF-β1刺激可顯著增加關節(jié)軟骨細胞中的葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生，這種現(xiàn)象有氧糖酵解或被稱為“Warburg效應”[16,17]。這是由于軟骨細胞的代謝在低氧條件下以糖酵解為主，但即使在高氧環(huán)境中，這種代謝模式仍能維持。由于健康軟骨中的細胞幾乎不會發(fā)生增殖，所以課題組推測增加的葡萄糖攝取和糖酵解代謝可能被用以TGF-β1相關的合成代謝提供能量；另一方面，軟骨細胞中氧化磷酸化過程受到限制后可以明顯減少活性氧自由基的產(chǎn)生，進而減少氧化應激對組織和細胞的損傷。我們在BMP2刺激后的細胞中觀察到氧化磷酸化代謝的明顯增強，這與關節(jié)軟骨發(fā)生肥大增生時的細胞代謝特點相似，提示在OA病情發(fā)展的過程中可能發(fā)生了能量代謝的重編程，軟骨細胞向有氧代謝傾斜，代謝模式的改變導致細胞損傷的加重和炎癥反應。

有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在正常的年輕小鼠關節(jié)軟骨細胞中誘導的代謝與老年OA模型小鼠截然不同，這是由于TGF-β蛋白可以激活細胞內(nèi)的多種不同的級聯(lián)信號，具體發(fā)揮何種生物功能依賴于其所處的細胞環(huán)境有關，生理情況下，TGF-β能促進軟骨細胞合成細胞外基質(zhì)，維持軟骨細胞的正常表型，使關節(jié)軟骨具有最大限度地吸收、緩沖應力的生物力學特性；病理狀態(tài)下，TGF-β對軟骨具有破壞作用，關節(jié)軟骨出現(xiàn)血管化和局灶性鈣化的表現(xiàn)，同時促進滑膜細胞增殖、炎癥細胞浸潤和纖維化引起關節(jié)滑膜炎。但是是否可以將TGF-β應用于骨關節(jié)炎相關疾病的治療目前尚有爭議。在之后的研究中，課題組將著重闡明TGF-β信號促進糖酵解代謝和維持代謝穩(wěn)態(tài)的內(nèi)在分子機制，這將為闡釋OA的具體發(fā)病機制提供重要線索。

總之，本研究成功發(fā)現(xiàn)激活TGF-β和BMP信號會在OA患者的關節(jié)軟骨細胞中啟動不同的糖代謝途徑，證實代謝途徑的重編程可能是調(diào)控關節(jié)軟骨細胞在骨關節(jié)炎背景下?lián)p傷的重要機制之一。同時，對于關節(jié)軟骨細胞能量代謝平衡的靶向調(diào)控有望成為臨床骨關節(jié)炎的全新治療方法。