張玉敏 韓素桂 劉啟為 周 琪 盧軍利

(唐山市人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，唐山 063000)

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)是指由各種原因?qū)е碌哪X組織血液供應(yīng)障礙，并由此產(chǎn)生缺血缺氧性壞死，進(jìn)而引起神經(jīng)功能障礙的一系列臨床綜合征，也稱為急性腦梗死，是最為常見的卒中類型，約占全部卒中的60%～80%[1]。在全球范圍內(nèi)，腦血管病占據(jù)致死疾病第二位，而在中國(guó)腦血管疾病致死中居于首位，我國(guó)腦卒中年發(fā)病率約為120～180/10萬(wàn)人，年死亡率高達(dá)60～120/10萬(wàn)人，未死亡的腦卒中患者約75%以上出現(xiàn)不同程度的殘疾[2,3]。因此，研究腦卒中的病理過(guò)程對(duì)腦卒中患者意義重大。

microRNA (miRNA)是一段長(zhǎng)度約為20 bp的非編碼RNA，通過(guò)與下游編碼或非編碼基因的3′UTR區(qū)域結(jié)合調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)蛋白表達(dá)水平，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及遷移等生物學(xué)進(jìn)程[4,5]。目前研究已經(jīng)證實(shí)，miRNA在人體各個(gè)組織器官?gòu)V泛表達(dá)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，其不僅是疾病診斷的優(yōu)質(zhì)分子標(biāo)志物，還參與多種疾病的病理過(guò)程[4,5]。近年來(lái)，隨著生物芯片技術(shù)不斷發(fā)展，多種miRNA在腦組織中被發(fā)現(xiàn)，并被證實(shí)參與多個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)展。Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-223在AIS患者血液和腦脊液中表達(dá)升高，并且其表達(dá)水平與腦卒中患者腦梗死體積和NIHSS評(píng)分有關(guān)，提示miR-223與AIS發(fā)病相關(guān)；Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn)，中風(fēng)后小鼠miR-126表達(dá)水平與心臟炎癥、心肌細(xì)胞肥大、心臟功能等有關(guān)。

miR-9是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，在老年癡呆患者血液中低表達(dá)，并參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化[8，9]。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，miR-9參與腦血管疾病發(fā)生，Qiu等[10]發(fā)現(xiàn)miR-9表達(dá)具有腦特異性，且在AIS患者血清外泌體高表達(dá)。然而，miR-9在AIS患者血清中的表達(dá)目前未見報(bào)道。研究miR-9在AIS患者血清中表達(dá)水平及其臨床意義對(duì)提高AIS患者確診率、明確疾病進(jìn)展階段及揭示AIS發(fā)病機(jī)制具有重要意義。因此，本文收集51例AIS患者血清和23例健康志愿者血清研究miR-9在AIS患者血清表達(dá)水平，探討miR-9表達(dá)與AIS患者血清炎癥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 隨機(jī)選取2017年6月～2019年6月在唐山市人民醫(yī)院接受治療的AIS患者51例(AIS組)和同期于我院體檢的健康志愿者23例(HC組)為研究對(duì)象。51例AIS患者經(jīng)核磁共振或者計(jì)算機(jī)斷層掃描確診，并在腦缺血24 h內(nèi)經(jīng)兩位副主任以上醫(yī)師對(duì)其進(jìn)行NIHSS評(píng)分。兩組患者年齡、性別、合并癥及體質(zhì)指數(shù)等臨床資料比較差異不顯著。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～65周歲；②AIS患者根據(jù)《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[1]確診；③AIS患者在出現(xiàn)缺血癥狀12 h內(nèi)且未治療前取血；④健康志愿者經(jīng)體檢確認(rèn)身體健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：①AIS患者發(fā)病時(shí)間不詳，或者未能在腦缺血24 h內(nèi)進(jìn)行NIHSS評(píng)分；②AIS患者經(jīng)治療后死亡；③合并惡性腫瘤、腦血管疾病、肝腎功能障礙或凝血功能障礙的患者；④有HIV、HBV、HCV及結(jié)核等病毒或真菌感染史的患者。本次研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與患者或其家屬知情同意。

1.1.2試劑 miRNeasy RNA isolation試劑盒(Qiagen，美國(guó))；RNAiso Plus、PrimeScri RT reagent kit with gDNA Eraser (TAKARA,寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；GoTaq Green Master Mix(Promega，美國(guó))；IL-6 、IL-8 (H-EL-IL-8,ZYscience,美國(guó))；TNF-α (50R-E.1693H,BIOVALUE,美國(guó))；IL-1β (50R-E.1095H,BIOVALUE,美國(guó)) ；THP-1 (美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù),美國(guó))；胎牛血清、1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))；miR-9-NC(5′-UCTTTTCAAGCGTTCAGTCCC-3′)，miR-9-mimic(5′-UCUUUGGUUAUCUAGCUG-UAUGA-3′)和miR-9-inhibitor(5′-AGAAACCAAUG-CGACAUACU-3′)由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，并直接轉(zhuǎn)染；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))；TransDetect雙熒光素酶報(bào)告分析試劑盒(全式金，中國(guó))。S1000 PCR儀 (伯樂(lè)，中國(guó))；ABI7500熒光定量PCR儀(ABI,美國(guó))；5810R離心機(jī)(eppendof，美國(guó))；DNM-9602酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司,中國(guó))。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR RNA試劑盒提取血清和細(xì)胞中總RNA。反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄cDNA，反轉(zhuǎn)錄溫度設(shè)定：37℃ 1 min，85℃ 5 s，4℃保存?zhèn)溆?。將獲得的cDNA稀釋50倍，根據(jù)GoTaq Green Master Mix說(shuō)明書配制20 μl熒光定量PCR反應(yīng)體系：95℃ 2 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)40次。2-ΔΔCt法計(jì)算miR-9的相對(duì)表達(dá)水平。miR-9-F:5′-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGTTATCTAGCT-3′;miR-9-R:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′;U6-F:5′-CTCGCTTCGGCAG-CACA-3′;U6-R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.2ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子 分別用試劑盒檢測(cè)血清IL-8、TNF-α、IL-6和IL-1β含量，具體步驟參照說(shuō)明書。

1.2.3外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 離心棄外周血血清，按血液：培養(yǎng)基體積=1∶2向血細(xì)胞中加入1640培養(yǎng)基，緩慢加入體積為培養(yǎng)基和血細(xì)胞體積一半的人外周血淋巴細(xì)胞分離液，室溫2 200 r/min離心30 min后，取中間白色懸浮層，加入3倍體積的PBS緩沖液洗滌3遍，離心收集沉淀，即為人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶檢測(cè) THP-1和分離的PBMC均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃。10 nmol/L的miR-9-NC、miR-9-mimic和miR-9-inhibitor經(jīng)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后48 h 開始對(duì)SIRT1的野生型(WT)或突變型(MUT)mRNA 3′-UTR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將基因插入 pisCHECK2載體，經(jīng)LipofectamineTM2000直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞。 并使用TransDetect雙熒光素酶報(bào)告分析試劑盒進(jìn)行雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。Westren blot檢測(cè)THP-1和健康志愿者PMBC中SIRT1表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件分析本次研究數(shù)據(jù)。Pearson法分析兩組數(shù)據(jù)間的相關(guān)性，兩組間數(shù)據(jù)差異行t檢驗(yàn)，單因素方差分析用于比較3組數(shù)據(jù)間差異(Ducan法事后檢驗(yàn))。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1miR-9在AIS患者血清中表達(dá) 如圖1A所示，miR-9在51例AIS患者血清中表達(dá)水平是健康志愿者的(3.25 ± 1.02)倍。且51例AIS患者血清miR-9的相對(duì)表達(dá)水平與其NIHSS評(píng)分及患者腦梗死體積呈正相關(guān)(r=0.674,P<0.001)和(r=0.544,P<0.001) (圖1B、C)。

2.2miR-9在AIS患者血清中表達(dá)與血清炎癥因子相關(guān)性 51例AIS患者血清miR-9的相對(duì)表達(dá)水平與血清IL-6 (r=0.558,P<0.001)、IL-8 (r=0.581,P<0.001)、TNF-α (r=0.626,P<0.001) 及IL-1β (r=0.668,P<0.001) 水平均呈正相關(guān)(圖2)。

2.3miR-9抑制PBMC中SIRT1表達(dá) THP-1細(xì)胞是從人外周血分離的單核細(xì)胞系，常用于研究外周血炎癥與免疫。通過(guò)Targetscan(http://www.targetscan.org)等生物信息學(xué)網(wǎng)站分析顯示， SIRT1與miR-9具有互補(bǔ)序列(圖3A)。如圖3B所示，轉(zhuǎn)入miR-9-mimic后，THP-1細(xì)胞miR-9表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)；在轉(zhuǎn)入miR-9-inhibitor后，miR-9表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)。雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)顯示，miR-9-mimic可顯著降低野生型SIRT1熒光素酶活性(P<0.001)，而不能改變突變型SIRT1熒光素酶活性(圖3C)。Western blot結(jié)果顯示，miR-9-mimic可顯著降低THP-1細(xì)胞和健康志愿者PBMC中SIRT1蛋白表達(dá)水平(P<0.001)；miR-9-inhibitor可顯著升高THP-1細(xì)胞和健康志愿者PBMC中SIRT1蛋白表達(dá)水平(P<0.001)。

圖1 miR-9在血清中表達(dá)及其與AIS患者NIHSS評(píng)分、腦梗死體積的關(guān)系Fig.1 Expression of miR-9 in serum and its relationship with NIHSS score and cerebral infarction volume in patients with AIS

圖2 AIS患者血清miR-9與IL-6、IL-8、TNF-α及IL-1β的相關(guān)性Fig.2 Correlation between serum miR-9 with IL-6,IL-8,TNF-α and IL-1β in patients with AIS

圖3 miR-9靶向抑制PBMC中SIRT1的表達(dá)Fig.3 miR-9 targeting inhibits expression of SIRT1 in PBMCNote:A.WT SIRT1 and MUT SIRT1 fluorescein gene reporter vector sequences;B.Expression level of miR-9 was detected by RT-qPCR;C.Comparison of luciferase activity after treating THP-1 cells in different ways;D,F.Expression of SIRT1 detected by Western blot.Compared with miR-9-NC group,***.P<0.001.

3 討論

AIS是由于腦動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致的腦組織梗死，伴隨神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷，是致死和致殘最重要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管事件。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-9在AIS患者血清中表達(dá)水平顯著高于健康志愿者，且miR-9在血清中表達(dá)水平與AIS患者NIHSS評(píng)分和腦梗死體積有關(guān)。既往研究指出，miR-9在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。Delavar等[11]在MTPP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的帕金森細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，miR-9的表達(dá)顯著改變，且其參與PC12細(xì)胞的分化調(diào)控；Gu等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-9通過(guò)靶向抑制HDAC5表達(dá)而過(guò)激活MEF2C-GPM6A途徑，促進(jìn)神經(jīng)突發(fā)育。結(jié)合本研究結(jié)果，提示miR-9可能參與AIS的發(fā)生發(fā)展。

大腦雖然只占人體重量的2%，但其耗氧量卻占人體全部耗氧量的20%，且大腦存儲(chǔ)能量能力極差，造成大腦對(duì)缺氧性損傷的耐受差，因缺血而導(dǎo)致氧氣供應(yīng)不足會(huì)造成嚴(yán)重的腦組織損傷[13]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)因缺血而失控的炎癥反應(yīng)是引起腦缺血繼發(fā)性損傷的主要原因之一。腦缺血會(huì)導(dǎo)致各種炎癥細(xì)胞因子表達(dá)升高從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或者凋亡，破壞血腦屏障，血腦屏障的破壞會(huì)進(jìn)一步加重炎癥，導(dǎo)致更多的神經(jīng)元和腦細(xì)胞損傷或死亡，形成惡性循環(huán)[14]。炎癥介質(zhì)可刺激細(xì)胞黏附因子升高，造成中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞滲出，引發(fā)缺血性組織炎癥[14]?？傊?，炎癥在AIS腦組織損傷中發(fā)揮重要作用，抑制炎癥是治療AIS患者的重要方案之一[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-9在51例AIS患者血清表達(dá)水平及血清IL-8、TNF-α、IL-6和IL-1β含量呈正相關(guān)。既往研究證實(shí)，細(xì)胞因子是介導(dǎo)腦缺血后神經(jīng)毒性的主要參與者，主要的神經(jīng)毒性作用包括IL-1β，TNF-α介導(dǎo)的神經(jīng)水腫，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)增生，神經(jīng)元中Ca2+增加，釋放白細(xì)胞[18]。總而言之，腦缺血后異常增加的炎癥是神經(jīng)元損傷的主要原因之一。本研究提示，miR-9可能通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與AIS疾病發(fā)展。

miR-9作為一種miRNA并不編碼蛋白質(zhì)，只能通過(guò)調(diào)控其靶基因間接參與細(xì)胞調(diào)控。為進(jìn)一步研究miR-9對(duì)AIS患者炎癥的調(diào)控作用，本研究通過(guò)生物學(xué)信息手段查詢到SIRT1是miR-9的靶基因，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miR-9靶向抑制THP-1細(xì)胞的SIRT1表達(dá)；同時(shí)miR-9-mimic可顯著抑制健康志愿者PBMC中SIRT1蛋白表達(dá)，而miR-9-inhibitor可增加健康志愿者PBMC中SIRT1蛋白表達(dá)。提示在AIS患者血清中高表達(dá)的miR-9可能靶向抑制PBMC中SIRT1蛋白表達(dá)。

SIRT1是sirtuin蛋白家族成員，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙酰化酶，其不僅可以通過(guò)去乙酰化組蛋白維持染色質(zhì)和基因組穩(wěn)定，還可通過(guò)其去乙?；墙M蛋白功能參與細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)控[19]。既往研究指出，上調(diào)SIRT1不僅可以降低膿毒血癥小鼠體內(nèi)炎癥性損傷，還可通過(guò)其去乙?；δ芏种苝65蛋白進(jìn)入細(xì)胞核而抑制NF-κB信號(hào)通路激活進(jìn)而減輕炎癥，表明SIRT1在細(xì)胞中發(fā)揮炎癥抑制基因的功能，而miR-9可能通過(guò)抑制SIRT1表達(dá)而上調(diào)炎癥[20-22]。

綜上所述，miR-9在AIS患者血清高表達(dá)，且高表達(dá)的miR-9與AIS患者病情及血清炎癥呈正相關(guān)，這可能與miR-9抑制PBMC中SIRT1表達(dá)有關(guān)。