張鑫月，蔣筱蝶，李沅秋，羅朝兵，，唐 昊，

（1 樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川樂山 614000；2 竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室）

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TF）通過目標(biāo)基因的啟動子區(qū)域的結(jié)合在激活基因表達(dá)的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用?；玖涟彼崂湥╞ZIP）結(jié)構(gòu)域，包含一個堿性氨基酸區(qū)域和一個由60～80個氨基酸殘基構(gòu)成的亮氨酸拉鏈[1-2]，是真核生物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，通常與植物的生物或非生物脅迫相關(guān)，參與了植物中許多重要的生理生化過程[3]。堿性氨基酸區(qū)域有一個保守的N-x7-R/K基序，負(fù)責(zé)DNA的結(jié)合和核定位，而亮氨酸拉鏈區(qū)由多個亮氨酸殘基及其它疏水性氨基酸（如異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸等）形成的7次重復(fù)[4]。

目前，通過使用全基因組分析，在多種植物中預(yù)測并確定了大量的bZIP轉(zhuǎn)錄因子，如在擬南芥[1]中發(fā)現(xiàn)了75個bZIP轉(zhuǎn)錄因子，在水稻[5]中鑒定的89個bZIP轉(zhuǎn)錄因子，在高粱[6]中鑒定的92個bZIP轉(zhuǎn)錄因子，玉米[7]中鑒定的125個bZIP轉(zhuǎn)錄因子，二穗短柄草[8]中鑒定的96個bZIP轉(zhuǎn)錄因子，小麥[9]中鑒定的187個bZIP轉(zhuǎn)錄因子等。此外，大量的研究表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子在許多組織和器官的發(fā)育方面具有重要作用，如維管束的發(fā)育、花的誘導(dǎo)和發(fā)育[10-12]、種子的成熟和萌發(fā)[13-14]。同時，其他研究也報道了bZIP轉(zhuǎn)錄因子在脫落酸（ABA）[15]、赤霉素（GA）[16]、乙烯[17]激素水平引起的調(diào)控和對病原體感染[18]、干旱[19]、寒冷[20]、高溫[21]和高鹽[22]的應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

慈竹（Bambusa emeiensis）是叢生竹類，廣泛分布于我國南方地區(qū)，被廣泛應(yīng)用于造紙及園林綠化等領(lǐng)域[23]，如在造紙領(lǐng)域，按照竹種對造紙質(zhì)量的影響進(jìn)行分級排序，竹種可以被分為4級，而慈竹為第一級[24]。長足大竹象（Cyrtotrachelus buquet）屬鞘翅目象甲科，是主要的竹林害蟲之一。成蟲期的長足大竹象可將喙完全伸入幼嫩竹筍內(nèi)部，取食竹腔內(nèi)層[25]，引起竹腔變黑、腐爛，造成新生竹發(fā)育不良，形成膿包竹及造成大量退筍，這將極大地影響了慈竹的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[26-27]。

目前尚未有慈竹基因組草圖公布和慈竹在蟲害（長足大竹象）生物脅迫下bZIP轉(zhuǎn)錄因子的分析，因此結(jié)合蟲害（長足大竹象）取食脅迫下慈竹轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果及生物信息學(xué)分析，對慈竹的bZIP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行鑒定及分析，以期發(fā)現(xiàn)bZIP轉(zhuǎn)錄因子在慈竹抗蟲害表征中所發(fā)揮的作用，同時為研究慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物和長足大竹象材料的準(zhǔn)備和處理

新鮮慈竹竹筍樣本采集于四川省樂山市沐川縣。長足大竹象于2017年8月收集于四川省沐川縣，成蟲在出土后3日喂養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中（保持26℃恒溫和70%的濕度，并維持16h的光照及8h的黑暗處理）。在試驗處理前，使長足大竹象處于饑餓狀態(tài)24h。

取100只經(jīng)饑餓處理后長足大竹象成蟲置于新鮮竹筍上，分為長足大竹象未取食的竹筍部位（Group1）及同一竹筍上長足大竹象取食的竹筍部位（Group3），同一叢竹筍中另外竹筍上長足大竹象完全未取食的竹筍部位（Group2）3個組別，Group1和Group2取樣的部位盡量保持在不同竹筍上近似的部位。實驗的詳細(xì)處理方法參照李沅秋等[28]的試驗方法。

1.2 慈竹轉(zhuǎn)錄組中bZIP轉(zhuǎn)錄因子序列的獲得

提取慈竹竹筍RNA，經(jīng)質(zhì)量檢測后用Illumina HiSeqTM2000平臺測序。將測序得到的原始數(shù)據(jù)過濾掉低質(zhì)量和冗余的Reads讀段后，采用Trinity軟件對數(shù)據(jù)從頭組裝及拼接，最終得到慈竹的轉(zhuǎn)錄本Transcripts，并從中選取最主要的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene序列，于進(jìn)一步對Unigene數(shù)據(jù)進(jìn)行去冗余處理并得到非冗余Unigene庫。對Unigene序列進(jìn)行基因功能注釋[29-30]。根據(jù)注釋結(jié)果搜索“Basic leucine zipper”，查找與檢索詞相關(guān)的Unigene名稱，手動調(diào)取Transcript.fa中上述Unigene序列，去除掉序列小于200bp的Unigene基因序列信息。

1.3 慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定及其蛋白質(zhì)的性質(zhì)分析

利用ORFFinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）功能查找每個基因的ORF，只保留氨基酸殘基數(shù)大于100的相應(yīng)核苷酸序列作進(jìn)一步分析。利用Prot-Param程 序（http://web.expasy.org/protparam/）對bZIP蛋白進(jìn)行相關(guān)性質(zhì)參數(shù)的預(yù)測[31]。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及保守motif的分析

在Plant Transcription Factor Database（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/.）中下載山羊草（Aegilops tauschiia）bZIP蛋白序列，使用DNAMAN6.0及MEGA 7.0軟件對慈竹及山羊草的bZIP蛋白進(jìn)行多序列比對，然后在MEGA 7.0軟件中的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建方法中選用鄰接法并設(shè)置1000次重復(fù)bootstrap檢驗、Poisson模型構(gòu)建bZIP蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹[32-33]。利用在線網(wǎng)站（http:// meme-suite.org/index.html）并使用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置[34]對bZIP蛋白進(jìn)行motif的分析。

1.5 慈竹bZIP表達(dá)模式

根據(jù)慈竹中鑒定出的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)豐度值，將值導(dǎo)入MeV 4.9.0分析軟件中，制作熱圖并進(jìn)行聚類分析[35]。

2 結(jié)果分析

2.1 bZIP蛋白的性質(zhì)分析

根據(jù)ORFFinder查找結(jié)果，篩選出10個大于100個氨基酸的ORF序列。這些bZIP蛋白的ORF的氨基酸含量差別較大，最長ORF的氨基酸數(shù)從149（comp719_seq1）到641（comp9572_seq1）；相對分子量位于16221.19 Da （comp719_seq1）到68353.04 Da（comp9572_seq1）之間；等電點介于 4.56（comp4125_seq0）～9.73（comp10711_seq0）之間；此外，蛋白質(zhì)的親水性總平均值結(jié)果表明慈竹bZIP蛋白均為親水性蛋白質(zhì)（表1）。

表1 慈竹bZIP蛋白的相關(guān)性質(zhì)

圖1 慈竹及部分山羊草bZIP轉(zhuǎn)錄因子的序列比對圖

2.2 慈竹bZIP蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

bZIP結(jié)構(gòu)域包含有2部分，一個是包括核定位信號以及可以結(jié)合DNA序列的N-x7-R/K基序在內(nèi)的一段堿性區(qū)域，另一段是亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，具有L-x6-L-x6-L結(jié)構(gòu)，參與bZIP蛋白與DNA的二聚化[4]。從NCBI下載6條已知的慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列，并從Plant Transcription Factor Database中挑選出20條山羊草bZIP轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列，利用MEGA7.0和DNAMAN軟件對這36條bZIP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多序列比對。在這10個新鑒定的慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列中，它們的堿性氨基酸區(qū)域內(nèi)的N-x7-R/K位點具有極高的保守型，說明該結(jié)構(gòu)域在bZIP在結(jié)合啟動子區(qū)上起關(guān)鍵的作用。10個新鑒定的bZIP轉(zhuǎn)錄因子中，有9個bZIP轉(zhuǎn)錄因子具有完整的結(jié)構(gòu)域，而comp10711_seq0在核定位信號存在一定的殘缺。此外，對bZIP轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸殘基進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在堿性氨基酸區(qū)后接的7重重復(fù)的亮氨酸拉鏈區(qū)域，前3個重復(fù)的亮氨酸（L）在相應(yīng)位點上較保守，但在少數(shù)情況下會被纈氨酸（V）和甲硫氨酸（M）等替代（圖1）。

2.3 慈竹及山羊草bZIP轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

從NCBI的protein數(shù)據(jù)庫中以“Bambusa emeiensis bZIP”為索引下載的6條已知的慈竹bZIP序列，20條從Plant Transcription Factor Database中下載的山羊草bZIP轉(zhuǎn)錄因子序列及10條新鑒定的慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子，利用MEGA 7.0軟件中CLUSTAL W功能對這36條bZIP蛋白序列進(jìn)行比對，繪制出慈竹bZIP蛋白的進(jìn)化樹（圖2）。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果，可以將36條序列分為3組。Group 1含有19條序列（包括慈竹comp10711_seq0、BebZIP4、comp4125_seq0等8條慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子），Group 2含有包括comp8646_seq0、BebZIP3在內(nèi)的4條序列。Group 3共有13條序列（包含BebZIP2、comp_seq1和comp2588等在內(nèi)的6個慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子）。

圖2 慈竹及山羊草bZIP轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子motif分析

利用MEME軟件分析慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子的motif（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：有15個慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子含有motif1，結(jié)合motif1的氨基酸代表性序列，可推測其主要包含核定位信號，可以結(jié)合DNA序列的N-x7-R/K基序在內(nèi)的一段堿性區(qū)域及部分亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，這與多序列比對結(jié)果相吻合（圖1）。此外，有1個慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子（comp10711_seq0）未檢測到motif1，但其與已經(jīng)鑒定的慈竹BebZIP4的序列對比，可知comp10711_seq0 bZIP結(jié)構(gòu)域存在殘缺，可能是由于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接不完整導(dǎo)致的序列不完整。

圖3 慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子motif分析

2.5 慈竹bZIP基因表達(dá)分析

根據(jù)本試驗的結(jié)果（圖4）：在不同竹筍的未被取食部位（Group1與Group2），bZIP轉(zhuǎn)錄因子在慈竹中表達(dá)模式基本相同，而在同一根竹筍的取食與未被取食部位（Group1與Group3），而在經(jīng)長足大竹象取食前后出現(xiàn)表達(dá)量的明顯變化，初步說明bZIP轉(zhuǎn)錄因子可能參與了慈竹對蟲害的響應(yīng)。其中comp8738_seq0、comp10711_seq0、comp4125_seq0、comp2588_seq0，在未取食部位與取食部位，表達(dá)量變化較為明顯，說明這幾個bZIP轉(zhuǎn)錄因子可能對慈竹抵御蟲害有重要作用；此外，comp719_seq1在3組中含量均高，表明可能與竹筍的生長發(fā)育有關(guān)。

圖4 慈竹bzip基因的表達(dá)模式

3 討論與結(jié)論

bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)生物與非生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)中具有非常重要的作用[18-22]。通過生物信息學(xué)手段對慈竹的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從中新鑒定出10個慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子。

通過系統(tǒng)進(jìn)化樹上的聚類分析，發(fā)現(xiàn)BebZIP3和comp8646_seq0，BebZIP4和comp10711_seq0同源性較高；同源性較高的基因，其功能也可能具有相似性。在早前的慈竹bZIP研究中已鑒定出6個慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子，其中BebZIP2、BebZIP5和BebZIP6轉(zhuǎn)錄因子參與了鹽、干旱和ABA引起的非生物脅迫應(yīng)激響應(yīng)[36-38]，BebZIP1轉(zhuǎn)錄因子可能參與了慈竹中組蛋白基因的表達(dá)，進(jìn)而影響其功能，從而改變慈竹的生長發(fā)育的調(diào)控[36，39-40]；BebZIP3轉(zhuǎn)錄因子可能有助于提高慈竹對多種非生物脅迫的適應(yīng)能力[36，41]，而BebZIP4的調(diào)控功能尚不清晰。此外，根據(jù)長足大竹象取食慈竹筍前后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果，10個新鑒定的慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子在取食處理前后，表達(dá)量各有差異。其中comp8738_seq0、comp10711_seq0、comp4125_seq0、comp2588_seq0等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量差異極為明顯，推測這幾個慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子與長足大足象取食導(dǎo)致的慈竹應(yīng)激脅迫響應(yīng)相關(guān)。comp2588_seq0在受到長足大竹象取食脅迫后表達(dá)量下調(diào)，其具體原因還有待進(jìn)一步分析。comp8738_seq0、comp10711_seq0、comp4125_seq0表達(dá)量上調(diào)，且它們和山羊草的EMT13093、EMT18702具有較高的同源性，而與這2個山羊草同源的水稻bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)，同時作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力傳感器，激活轉(zhuǎn)錄因子BZIP50和伴侶BIP1[42-43]，因此推測comp8738_seq0、comp10711_seq0、comp4125_seq0可能也具有類似的調(diào)控作用，即通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)來應(yīng)對長足大竹象的取食脅迫。

本研究通過對慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測及在長足大竹象取食脅迫下bZIP轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量變化的分析，將為慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)蟲害方面的研究提供一定的借鑒意義。